ORDIN   Nr. 471 din 10 octombrie 2002

pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind planurile de prelevare, metodele de diagnostic, determinarea si confirmarea prezentei septicemiei hemoragice virale - SHV - si necrozei hematopoetice infectioase - NHI - la pesti

ACT EMIS DE: MINISTERUL AGRICULTURII, ALIMENTATIEI SI PADURILOR

ACT PUBLICAT IN: MONITORUL OFICIAL  NR. 857 din 27 noiembrie 2002

    In temeiul prevederilor art. 31 alin. 1 din Legea sanitara veterinara nr. 60/1974, republicata, cu modificarile si completarile ulterioare,
    in baza Hotararii Guvernului nr. 362/2002 privind organizarea si functionarea Ministerului Agriculturii, Alimentatiei si Padurilor, cu modificarile si completarile ulterioare,
    vazand Referatul de aprobare nr. 159.465 din 16 septembrie 2002, intocmit de Agentia Nationala Sanitara Veterinara,

    ministrul agriculturii, alimentatiei si padurilor emite urmatorul ordin:

    Art. 1
    Se aproba Norma sanitara veterinara privind planurile de prelevare, metodele de diagnostic, determinarea si confirmarea prezentei septicemiei hemoragice virale - SHV - si necrozei hematopoetice infectioase - NHI - la pesti, prevazuta in anexa care face parte integranta din prezentul ordin.
    Art. 2
    Agentia Nationala Sanitara Veterinara, institutele centrale de profil si directiile sanitare veterinare judetene si a municipiului Bucuresti vor aduce la indeplinire prevederile prezentului ordin.
    Art. 3
    Agentia Nationala Sanitara Veterinara va controla modul de aplicare a prevederilor prezentului ordin.
    Art. 4
    La data intrarii in vigoare a prezentului ordin se abroga orice alta dispozitie contrara.
    Art. 5
    Prezentul ordin va fi publicat in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I.

              Ministrul agriculturii, alimentatiei si padurilor,
                                Ilie Sarbu

    ANEXA 1

                         NORMA SANITARA VETERINARA
privind planurile de prelevare, metodele de diagnostic, determinarea si confirmarea prezentei septicemiei hemoragice virale - SHV - si necrozei hematopoetice infectioase - NHI - la pesti

    PREVEDERI GENERALE

    Art. 1
    In sensul prezentei norme sanitare veterinare, se prevad:
    a) liniile directoare si reglementarile minime care se aplica planurilor de prelevare si metodelor de diagnostic pentru detectarea si confirmarea prezentei septicemiei hemoragice virale - SHV - si necrozei hematopoetice infectioase - NHI;
    b) integrarea dispozitiilor Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 494/2001 pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind conditiile de sanatate a animalelor, care reglementeaza punerea pe piata a animalelor si a produselor de acvacultura, publicat in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I, nr. 191 din 21 martie 2002, cu privire la agrearea si mentinerea agrearii zonei si a unitatilor in zonele neagreate;
    c) stabilirea dispozitiilor care vizeaza diagnosticul corect al SHV si NHI si recunoasterea oficiala a statutului de zona agreata si unitate agreata in zona neagreata, in conformitate cu Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 494/2001;
    d) stabilirea conduitei autoritatilor responsabile cu controlul SHV si NHI si personalului de laborator care realizeaza testele pentru aceste boli. In consecinta, accentul este pus pe procedurile de prelevare, principiile si aplicatiile testelor de laborator si evaluarea rezultatului acestora, precum si pe tehnicile de laborator in detaliu. Totusi, la nevoie, laboratoarele pot sa aduca modificari la testele descrise in aceasta anexa sau sa utilizeze teste diferite, cu conditia sa fie dovedite o sensibilitate si o specificitate echivalente. Partea I cuprinde planurile de prelevare si metodele de diagnostic pentru supravegherea SHV si NHI cu scopul de a obtine mentinerea statusului de zona agreata sau unitate agreata in zona neagreata. Partea a II-a descrie procedeele de diagnostic pentru confirmarea SHV si NHI in caz de suspiciune. Partea a III-a cuprinde criteriile si liniile directoare aplicabile unui program de inspectie sanitara veterinara oficiala care sa dovedeasca absenta anterioara a SHV si/sau NHI. Partea a IV-a furnizeaza recomandari asupra procedurilor de titrare a virusurilor NHI si SHV in scopul verificarii sensibilitatii culturilor celulare la infectie. In partea a V-a sunt enumerate acronimele si abrevierile.

    PARTEA I
    Planurile de prelevare si metodele de diagnostic pentru supravegherea septicemiei hemoragice virale - SHV - si necrozei hematopoetice infectioase - NHI - la pesti pentru obtinerea si mentinerea agrearii unei zone sau unei unitati dintr-o zona neagreata

    CAP. 1
    Inspectii si prelevare

    Art. 2
    Dispozitii generale relative la inspectiile sanitare veterinare clinice, la colectarea si selectionarea probelor pentru supravegherea zonelor sau unitatilor situate in zone neagreate, in scopul obtinerii sau mentinerii agrearii pentru SHV si/sau NHI
    a) Inspectiile sanitare veterinare clinice si prelevarile de tesuturi de peste si/sau lichid ovarian se efectueaza in zone sau unitati situate in zone neagreate, in vederea obtinerii sau mentinerii agrearii pentru SHV si/sau NHI, in conformitate cu Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 494/2001. Alte detalii sunt prezentate in art. 3 - 5. Schemele de inspectie si recoltare prevazute in anexele nr. 1 si 2 nu se aplica unor unitati noi sau unitatilor care acum incep activitatea cu peste, icre sau lapti care provin din zone agreate sau din unitati agreate situate in zone neagreate, cu conditia ca ele sa indeplineasca cerintele prevazute in Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 494/2001.
    b) Inspectiile clinice trebuie sa fie efectuate in cursul perioadei cuprinse intre lunile octombrie si iunie sau cand temperatura apei este inferioara celei de 14 grade C. Atunci cand unitatile trebuie sa faca obiectul unei inspectii clinice de doua ori pe an, intervalele dintre inspectii trebuie sa fie de cel putin 4 luni. Toate unitatile de productie (bazine, cuve, viviere etc.) trebuie sa fie supuse unei inspectii destinate sa stabileasca prezenta de pesti morti, agonici sau cu comportament anormal. O atentie particulara trebuie sa fie acordata punctului de evacuare a apei, unde pestii agonici au tendinta sa se acumuleze in curentul de apa.
    c) Pestii care se preleveaza sunt selectionati dupa cum urmeaza:
    1. daca sunt prezenti pastravi curcubeu, singurii care se preleveaza sunt acestia; daca acestia nu sunt prezenti, prelevarea se compune din toate speciile prezente, in masura in care aceste specii sunt sensibile la virusurile SHV si/sau NHI si in conformitate cu Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 494/2001; in proba speciile trebuie sa fie reprezentate proportional;
    2. daca mai mult de o sursa de apa este utilizata pentru productia de peste, in proba prelevata trebuie sa fie inclusi pestii care sa reprezinte toate sursele de apa;
    3. daca sunt pesti in agonie, cu comportament anormal sau pesti morti recent, dar nu descompusi, acestia trebuie selectionati in primul rand; daca acesti pesti nu sunt prezenti, proba prelevata trebuie sa fie compusa din pesti cu aspect anormal, aparent sanatosi, din toate zonele din unitate, astfel ca toate clasele de varsta sa fie reprezentate proportional in proba.
    Art. 3
    Dispozitii specifice, incluzand colectarea probelor, relative la supravegherea zonelor sau unitatilor din zonele neagreate, in scopul obtinerii agrearii pentru SHV si/sau NHI
    a) O zona sau o exploatatie dintr-o zona neagreata, plasata sub controlul serviciilor sanitare veterinare, poate obtine agrearea pentru SHV si/sau NHI cu conditia sa se supuna unuia dintre urmatoarele doua programe:
    1. Modelul A - Program de supraveghere pentru 2 ani. Dupa cel putin 2 ani de absenta a unui semn clinic de SHV si/sau NHI, toate unitatile dintr-o zona sau orice unitate dintr-o zona neagreata destinata agrearii trebuie sa faca obiectul unei inspectii sanitare veterinare de doua ori pe an, timp de 2 ani. In timpul acestei perioade de control de 2 ani care precede obtinerea agrearii, absenta oricarui semn clinic de SHV si/sau NHI trebuie sa fie continua, iar prelevarile de probe sa se efectueze in conformitate cu anexa nr. 1. In plus, probele trebuie sa fie selectionate, prelucrate si examinate conform dispozitiilor art. 2 - 5, iar examenele de laborator trebuie sa fie negative pentru SHV si/sau NHI;
    sau
    2. Modelul B - Program de supraveghere pentru 2 ani, cu o marime redusa a probei prelevate. Ca urmare a unui program de inspectii sanitare veterinare oficiale care poate dovedi absenta SHV si/sau NHI pentru cel putin 4 ani, toate unitatile din zona sau orice unitate dintr-o zona neagreata, destinata agrearii, trebuie sa faca obiectul unei inspectii sanitare veterinare de doua ori pe an, timp de 2 ani. In cursul acestei perioade care preceda obtinerea agrearii, absenta semnelor clinice sau a altor semne de SHV si/sau NHI trebuie sa fie continua, iar probele se preleveaza pentru examen in conformitate cu anexa nr. 2. In plus, prelevarile trebuie sa fie selectionate, pregatite si examinate conform dispozitiilor art. 2 - 5, iar examenele de laborator sa fie negative pentru SHV si/sau NHI.
    Pentru ca un program de inspectii sanitare veterinare sa fie recunoscut de catre serviciile sanitare oficiale ca facand dovada absentei anterioare a SHV si/sau NHI, trebuie sa indeplineasca si sa respecte criteriile stabilite in partea a III-a.
    b) Dispozitii speciale sunt aplicabile in unitatile nou-agreate si in unitatile care incep activitatea cu pesti, icre sau lapti provenind dintr-o zona agreata sau dintr-o unitate agreata dintr-o zona neagreata.
    Unitatile noi sau unitatile care isi incep activitatea cu pesti, icre sau lapti provenind dintr-o zona agreata sau unitate agreata din zona neagreata pot obtine agrearea in conformitate cu Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 494/2001. In consecinta, dispozitiile de prelevare sunt stabilite in conformitate cu modelele A si B prevazute la lit. a) de mai sus.
    Art. 4
    Program de supraveghere pentru mentinerea agrearii pentru SHV si/sau NHI
    In scopul mentinerii agrearii intr-o zona sau intr-o unitate dintr-o zona neagreata pentru SHV si/sau NHI, inspectiile si prelevarea probelor pentru examen trebuie sa se efectueze in conformitate cu anexa nr. 3. Probele trebuie sa fie selectionate, pregatite si examinate in conformitate cu dispozitiile art. 2 - 5, iar rezultatele examenelor de laborator sa fie negative pentru SHV si/sau NHI.
    Art. 5
    Pregatirea si expedierea probelor de peste
    a) Inainte de a fi expediate sau transferate catre laborator, se preleveaza de la pesti organe sau fragmente de organe cu ajutorul instrumentelor de disectie si se transfera in tub de plastic steril continand mediu de transport - mediu de culturi celulare cu 10% ser fetal bovin si antibiotice. Se recomanda combinatia de 200 UI penicilina, 200 micrograme streptomicina si 200 micrograme kanamicina/ml, dar in aceeasi masura pot fi utilizate si alte antibiotice cu eficacitate demonstrata. Tesuturile pentru examinat sunt splina, rinichiul anterior si, dupa caz, cordul sau encefalul. In anumite cazuri trebuie examinat lichidul ovarian, in conformitate cu anexele nr. 1 - 3. Lichidul ovarian sau fragmente de organe de la maximum 10 pesti - anexele nr. 1 - 3 - pot fi comasate intr-un tub steril continand 4 ml mediu de transport si care sa reprezinte un esantion (pool) global. Tesuturile din fiecare pool trebuie sa fie in cantitate de cel putin 0,5 g.
    b) Tuburile cu probe se introduc intr-un recipient izolat, de exemplu o cutie de polistiren cu peretii grosi, cu o cantitate suficienta de gheata, care sa garanteze refrigerarea probelor pe timpul transportului pana la laborator. Trebuie evitata congelarea probelor. Temperatura probei pe timpul transportului nu trebuie sa depaseasca 10 grade C, recipientul de transport trebuie sa mai contina gheata cand ajunge la destinatie, iar blocul refrigerator trebuie sa fie partial sau total congelat.
    c) Examenul virusologic trebuie sa inceapa imediat sau cat mai curand posibil, cel tarziu in 48 de ore de la prelevarea probelor. In cazuri exceptionale, de exemplu atunci cand pestii provin din zone indepartate, fara posibilitate de expediere zilnica, examenul virusologic poate fi efectuat in 72 de ore de la colectarea materialului de examinat, cu conditia ca acesta sa fie protejat cu mediu de transport, iar conditiile de temperatura pe timpul transportului sa fie cele indicate mai sus. Se pot expedia si pesti vii. Conditiile de ambalare si etichetare trebuie sa respecte reglementarile nationale sau internationale in vigoare in materie de transport, daca este cazul.
    Art. 6
    Colectarea de material suplimentar pentru diagnostic
    De comun acord cu Institutul de Diagnostic si Sanatate Animala, si alte probe pot fi colectate si pregatite in vederea examenelor suplimentare.

    CAP. 2
    Prepararea probelor in vederea examenului virusologic

    Art. 7
    Congelarea in cazuri exceptionale
    Daca exista dificultati obiective, precum conditii climaterice defavorabile, zile nelucratoare, probleme de laborator, care impiedica inocularea celulelor in primele 48 de ore de la colectarea probelor de tesut, este admis ca probele sa fie congelate in mediu de cultura la -20 grade C sau la o temperatura inferioara, iar examenul virusologic sa se efectueze intr-o perioada de 14 zile. Totusi proba nu poate fi congelata si decongelata decat o singura data inaintea examinarii. Este necesar sa se tina un registru in care sa fie mentionate cauzele fiecarei congelari a probelor de tesut, de exemplu furtuni, linii celulare moarte etc.
    Art. 8
    Omogenizarea organelor
    In laborator, tesuturile trebuie sa fie complet omogenizate cu ajutorul unui stomaker sau cu mojar si nisip steril, dupa care produsul se introduce in mediul de transport original. Daca proba este compusa din pesti intregi mai mici de 4 cm lungime, acestia se fragmenteaza cu foarfecele steril dupa ce se elimina coada din spatele anusului. Daca proba este constituita din pesti cu dimensiuni de 4 - 6 cm, se colecteaza viscerele si rinichiul. Daca pestii sunt mai mari de 6 cm, tesuturile se recolteaza conform prevederilor cap. I art. 4. Probele de tesut se reduc la fragmente mici cu ajutorul foarfecelui steril sau bisturiului, se omogenizeaza si se introduc in mediul de transport, asa cum s-a mentionat mai sus. Raportul final intre materialul tisular si mediul de transport trebuie sa fie de 1:10.
    Art. 9
    Centrifugarea omogenatului
    a) Omogenatul este centrifugat in centrifuga cu racire, la o temperatura cuprinsa intre 2 - 5 grade C la 2.000 - 4.000 x g, timp de 15 minute, iar lichidul supernatant este colectat si tratat, fie 4 ore la 15 grade C, fie peste noapte la 4 grade C, cu antibiotice; de exemplu, 1 mg gentamicina/ml poate fi foarte util in acest stadiu. Daca proba a fost expediata in mediu de transport - adica sub antibiotic -, tratamentul lichidului supernatant nu mai este necesar. Tratamentul cu antibiotic vizeaza impiedicarea contaminarii bacteriene a probei si face inutila filtrarea prin filtru cu membrana. Daca lichidul supernatant colectat este congelat la -80 grade C in curs de 48 de ore de la prelevarea probei, acesta poate fi utilizat o singura data pentru examen virusologic.
    b) Daca exista dificultati obiective - incubator defect, probleme cu mediile de cultura celulare - care impiedica inocularea celulelor in primele 48 de ore de la prelevarea probelor de tesut, este admis ca lichidul supernatant sa fie congelat la -80 grade C, iar examenul virusologic sa fie executat in maximum 14 zile. Inainte de a inocula celulele, se amesteca supernatantul cu parti egale cu un pool de antiser contra serotipurilor indigene de virus al necrozei pancreatice infectioase - NPI -, diluat intr-o maniera adecvata si incubat timp de minimum o ora la 15 grade C sau maximum 18 ore la 4 grade C. Titrul antiserului trebuie sa fie cel putin 1/2.000 intr-un test de neutralizare a plajelor cu 50% - reducerea plajelor. Tratamentul efectuat prin inocularea cu ser antivirus NPI la culturile celulare - virus care in anumite regiuni din Europa este prezent in 50% din probele de peste - vizeaza impiedicarea aparitiei unui efect citopatic dat de NPI in respectivele culturi celulare. Acest tratament permite reducerea duratei examenului virusologic, astfel ca numarul de cazuri in care apare efectul citopatic sa fie considerat ca un indicator potential de SHV si/sau NHI. Atunci cand probele provin dintr-o unitate considerata indemna la NPI, tratamentul cu ser antivirus NPI poate fi omis.

    CAP. 3
    Examinarea virusologica

    Art. 10
    Culturile celulare si mediile de cultura
    a) Linii celulare Bluegill fry - BF2 - sau Rainbow trout gonad - RTG2 - si Epithelioma papulosum cyprini - EPC - sau Fathead minnow - FHM - sunt crescute la temperaturi de 20 - 30 grade C in mediu corespunzator, de exemplu Eagle's MEM sau modificari ale acestuia, cu un supliment de ser fetal bovin de 10% si antibiotice in concentratii standard.
    b) Cand celulele sunt cultivate in sisteme inchise, este recomandat ca mediul sa fie tamponat cu bicarbonat de sodiu. Mediul folosit pentru cultivarea celulelor in sisteme deschise poate fi tamponat cu Trishidroximetil aminometan - Tris-HCI, 23 mM si bicarbonat de sodiu, 6 mM; pH-ul trebuie sa fie 7,6 +/- 0,2.
    c) Culturile celulare folosite pentru inocularea cu omogenat de tesuturi trebuie sa fie tinere, 4 - 48 de ore, si in faza de crestere, neconfluente, la inoculare.
    Art. 11
    Inocularea culturilor celulare
    a) Suspensia de organe tratata cu antibiotice este inoculata pe culturi celulare in doua dilutii, de exemplu dilutia primara si in plus o dilutie de 1:10 din aceasta, rezultand dilutii finale ale omogenatului de organe in mediul de culturi celulare de 1:100 si, respectiv, 1:1.000, in scopul prevenirii interferentei omologilor. Cel putin doua linii celulare trebuie sa fie inoculate in conformitate cu prevederile art. 10 lit. a). Raportul dintre volumul inoculului - suspensia de organe tratata cu antibiotice - si volumul mediului de culturi celulare trebuie sa fie de aproximativ 1:10.
    b) Pentru fiecare dilutie si fiecare linie celulara trebuie sa fie utilizata o suprafata de aproximativ 2 cm^2, corespunzand unui godeu dintr-o placa cu 24 de godeuri. Folosirea placutelor cu godeuri este recomandata, dar sunt acceptate, de asemenea, si alte suporturi cu suprafata de crestere similara sau mai mare.
    Art. 12
    Incubarea culturilor celulare
    a) Culturile celulare inoculate sunt incubate la temperatura de 15 grade C pentru 7 - 10 zile. Daca culoarea mediului culturilor celulare vireaza de la rosu la galben, indicand o acidifiere a mediului, se va ajusta pH-ul mediului cu solutie sterila de bicarbonat de sodiu sau substante echivalente, pentru a asigura susceptibilitatea culturii celulare la infectie.
    b) La fiecare 6 luni sau daca este suspectata scaderea susceptibilitatii celulare, se va efectua calcularea titrului stocurilor de virusuri inghetate pentru SHV si NHI, pentru a verifica susceptibilitatea culturilor celulare la infectie. O procedura recomandata este prezentata in partea a IV-a.
    Art. 13
    Microscopia
    Culturile celulare inoculate trebuie sa fie inspectate zilnic sau cel putin de trei ori pe saptamana, cu scopul de a urmari aparitia efectului citopatic, cu un grosisment intre 40 x la 150 x. Daca efectul citopatic este evident, se incepe imediat procedura de identificare a virusului in conformitate cu partea I cap. IV.
    Art. 14
    Subcultivarea
    a) Daca nu se produce nici un efect citopatic in prima incubatie de 7 - 10 zile, se procedeaza la o subcultivare pe culturi celulare proaspete, utilizandu-se o suprafata celulara similara cu cea din cultura primara.
    b) Cantitatea de mediu - lichid supernatant - care provine din toate culturile/godeurile ce constituie cultura primara este adunata intr-un pool pentru fiecare linie celulara, la 7 - 10 zile dupa inoculare. Esantioanele - pool-urile - sunt apoi inoculate pe culturi celulare omoloage, nediluat si diluat 1/10, rezultand in final dilutii ale supernatantului de 1:10 si 1:100, astfel cum este descris in art. 11. Parti de 10% din mediul ce constituie cultura primara sunt inoculate direct intr-un godeu cu culturi celulare proaspete, subcultivare godeu la godeu. Inocularea poate fi precedata de o preincubare a dilutiilor cu antiser contra virusului NPI in dilutii corespunzatoare, in conformitate cu cap. II art. 9.
    c) Incubarea urmatoare, timp de 7 - 10 zile la 15 grade C, se face in conformitate cu art. 12.
    d) Daca se produce un efect citopatic toxic in primele 3 zile de incubatie, se poate realiza o subcultivare in acest stadiu, dar celulele trebuie sa fie incubate 7 zile, urmata de o subcultivare cu durata de incubatie tot de 7 zile. Atunci cand se produce un efect citopatic toxic dupa 3 zile, celulele pot fi pasate o data si incubate pentru a obtine un total de 14 zile de la prima inoculare. Nu trebuie sa existe semne de toxicitate in cursul ultimelor 7 zile de incubatie.
    e) Daca se produce o contaminare bacteriana in ciuda tratamentului cu antibiotice, subcultivarea trebuie precedata de o centrifugare la 2.000 - 4.000 x g timp de 15 - 30 de minute, la temperatura de 2 - 5 grade C, si/sau de o filtrare a supernatantului cu un filtru - membrana cu procent scazut de absorbtie a proteinei - de 0,45 micrometri. In plus fata de acest aspect, procedurile de subcultivare sunt aceleasi ca si cele care se aplica in cazul aparitiei efectului citopatic toxic.

    CAP. 4
    Identificarea virusului

    Art. 15
    Teste de identificare virala
    Daca se observa aparitia de efect citopatic in culturile celulare, mediul de cultura - supernatantul - este colectat si examinat prin una dintre urmatoarele tehnici: neutralizare, imunofluorescenta, ELISA.
    Daca prin aceste teste nu se definitiveaza identificarea virusului intr-o saptamana, supernatantul trebuie sa fie trimis la un laborator national de referinta sau la laboratorul de referinta al Uniunii Europene pentru bolile pestilor, in vederea identificarii imediate.
    Art. 16
    Neutralizarea
    a) Se indeparteaza celulele din supernatantul colectat, prin centrifugare la 2.000 - 4.000 x g sau filtrare prin membrana de 0,45 micrometri cu procent scazut de absorbtie a proteinelor, si se dilueaza supernatantul 1:100 si 1:10.000 in mediu de culturi celulare.
    b) Parti din cele doua dilutii ale supernatantului sunt amestecate separat si incubate pentru 60 de minute la 15 grade C cu parti egale din urmatorii reagenti:
    1. ser ce contine anticorpi anti virusul SHV la dilutie 1:50, vol:vol;
    2. ser ce contine anticorpi anti virusul IHN la dilutie 1:50, vol:vol;
    3. pool de antiser anti serotipurile indigene la virusul IPN la dilutie 1:50, vol:vol;
    4. doar mediu - martor pozitiv.
    c) 50 microlitri din fiecare amestec format din supernatantul cu virusul de identificat si ser se inoculeaza pe cel putin doua culturi celulare si se incubeaza la 15 grade C. Se urmareste aparitia efectului citopatic asa cum este descris in art. 13.
    d) Unele tulpini de virus SHV nu reactioneaza la testele de neutralizare. Astfel de izolate trebuie sa fie identificate prin imunofluorescenta - IF - sau ELISA.
    e) Pot fi utilizate alternativ si alte teste de neutralizare cu eficienta dovedita.
    Art. 17
    Imunofluorescenta - IF
    a) Pentru fiecare izolat viral care trebuie sa fie identificat este necesar sa se cultive cel putin 8 lamele sau echivalentul, cu celule la o densitate care sa asigure o confluenta de aproximativ 60 - 90% dupa 24 ore de la cultivare. Linia celulara EPC este recomandata pentru acest scop datorita aderentei sale puternice la suprafetele de sticla, dar pot fi folosite, de asemenea, si alte linii celulare cum sunt BF2, RTG2 sau FHM.
    b) Virusul care trebuie sa fie identificat se inoculeaza cand celulele s-au prins pe suprafata de sticla, la aproximativ o ora dupa tripsinizare, sau cand culturile au fost incubate pana la 24 ore. Patru culturi sunt inoculate la un raport volum la volum de 1:10 si patru culturi la un raport de 1:1.000. Acestea sunt apoi incubate la 15 grade C pentru 20 - 30 de ore.
    c) Dupa incubatie, culturile sunt clatite de doua ori in mediu Eagle's MEM fara ser fetal, se fixeaza in 80% acetona rece si se coloreaza apoi prin tehnica de imunofluorescenta indirecta - IFAT. Primul strat de reagent este reprezentat de anticorpi monoclonali sau policlonali la o calitate de referinta. Al doilea strat de reagent este reprezentat de un antiser - antiimunoglobulinele utilizate in primul strat -, conjugat cu fluorocrom. Pentru fiecare dintre antiserurile testate se utilizeaza cel putin o cultura inoculata cu doza crescuta si o cultura inoculata cu doza scazuta. Este necesara includerea in test a martorilor pozitivi si negativi. Este recomandata folosirea fluorocromilor fluorescein izotiocianat - FITC - sau tetrametil-rodamin-izotiocianat - TRITC.
    d) Lamelele cu culturi celulare tratate cu reagentii de mai sus se monteaza in glicerol salin. Se examineaza la microscop cu sursa de lumina ultravioleta - UV. Se utilizeaza oculare de 10 x sau 12 x si obiective de x 25 sau x 40 cu apertura mai mare de 0,7 si, respectiv, de 1,3.
    e) Tehnica de IF descrisa mai sus este un exemplu. Pot fi aplicate si alte tehnici de IF a caror eficacitate a fost dovedita: culturi celulare, fixare si anticorpi de referinta.
    Art. 18
    ELISA
    a) Godeurile din placa de microtitrare sunt captusite peste noapte cu dilutii stabilite de fractiuni de imunoglobuline purificate provenite din seruri de referinta.
    b) Dupa spalarea godeurilor cu tampon fosfat salin - PBS-Tween 20, virusul care trebuie identificat este pipetat in godeuri in trepte de dilutie din 2 in 2 sau din 4 in 4 si se lasa sa reactioneze cu anticorpii ce captusesc placa, timp de 60 de minute la 37 grade C. Dupa spalare cu tampon PBS-Tween 20, sunt adaugati anticorpii a caror specificitate corespunde cu cea a anticorpilor ce captusesc godeurile si se lasa sa reactioneze 60 de minute la 20 grade C. Dupa o alta spalare ca mai sus se adauga streptavidin conjugat cu peroxidaza din hrean - HRP - si se lasa sa reactioneze pentru o ora la 20 grade C. Dupa ultima spalare, enzima legata este vizualizata folosindu-se un substrat ELISA corespunzator.
    c) Reactia ELISA de mai sus cu biotina-avidina este un exemplu. Pot fi folosite si alte tipuri de ELISA cu eficienta dovedita.

    PARTEA a II-a
    Procedurile de diagnostic pentru confirmarea SHV si NHI in episoadele de boala

    Art. 19
    Una sau mai multe dintre urmatoarele tehnici trebuie sa fie efectuate pentru diagnosticul SHV si NHI:
    A. izolare virala cu identificare serologica ulterioara;
    B. izolare virala cu identificare serologica simultana;
    C. alte tehnici de diagnostic (IFAT, ELISA).
    Art. 20
    Confirmarea pentru prima data a SHV sau NHI in ferme din zone agreate nu trebuie efectuata numai prin metoda C. Trebuie folosita, de asemenea, ori metoda A ori B.
    Art. 21
    Probele de organe destinate examenului virusologic trebuie sa fie insotite in anumite cazuri de material suplimentar in vederea efectuarii examenelor bacteriologic, parazitologic, histologic sau a altor examene necesare diagnosticului diferential.

    A. Izolare virala cu identificare serologica ulterioara
    1. a) Selectia probelor: cel putin 10 pesti ce prezinta semne tipice de NHI sau SHV trebuie sa fie selectati pentru examinare.
    b) Pregatirea si expedierea probelor de peste: astfel cum este prevazut in partea I cap. I art. 5.
    c) Colectarea de material suplimentar pentru diagnostic: astfel cum este prevazut in partea I cap. I art. 6.
    2. Prepararea probelor in vederea examinarii virusologice: astfel cum este prevazut in partea I cap. II.
    3. Examinarea virusologica: astfel cum este prevazut in partea I cap. III.
    4. Identificarea virusului: astfel cum este prevazut in partea I cap. IV.

    B. Izolare virala cu identificare serologica simultana
    1. a) Selectia probelor: asa cum este prevazut la lit. A pct. 1 lit. a).
    b) Pregatirea si expedierea probelor de peste: astfel cum este prevazut in partea I cap. I art. 5.
    c) Colectarea de material suplimentar pentru diagnostic: astfel cum este prevazut in partea I cap. I art. 6.
    2. a) Omogenizarea organelor: astfel cum este prevazut in partea I cap. II art. 8.
    b) Centrifugarea omogenatului: omogenatul este centrifugat intr-o centrifuga cu racire la 2 - 5 grade C, la 2.000 - 4.000 x g, timp de 15 minute, iar supernatantul este colectat si tratat pentru 4 ore la 15 grade C cu antibiotice, de exemplu gentamicina 1mg/ml, sau filtrat prin membrana de 0,45 micrometri, cu procent scazut de legare a proteinei.
    c) Tratarea supernatantului cu antiser: suspensia de organe tratata cu antibiotice sau filtrata este diluata 1:10 si 1:1000 in mediu de culturi celulare, iar parti din acesta se amesteca si se incubeaza 60 de minute la 15 grade C cu parti egale din reagentii mentionati in partea I cap. IV art. 16.
    3. a) Culturile celulare si mediile de cultura: astfel cum sunt prevazute in partea I cap. III art. 10;
    b) Inocularea culturilor de celule: cel putin doua linii celulare sunt inoculate cu 50 microlitri din fiecare amestec virus - ser (preparat astfel cum este prevazut la pct. 2 de mai sus).
    c) Incubarea culturilor celulare: astfel cum este prevazuta in partea I cap. III art. 12.
    d) Microscopie
    - culturile celulare inoculate sunt controlate zilnic la microscop, pentru verificarea aparitiei efectului citopatic, la o marire de la 40 x la 150 x. Daca efectul citopatic este impiedicat sa apara de unul din antiserurile folosite, virusul poate fi considerat a fi identificat corespunzator;
    - daca nici unul dintre antiserurile folosite nu impiedica aparitia efectului citopatic, se procedeaza la identificarea virusului in conformitate cu cele prezentate in partea I cap. IV.
    e) Subcultivarea: daca nu se produce nici un efect citopatic in 7 - 10 zile, se procedeaza la o subcultivare plecand de la culturi inoculate cu lichid supernatant si mediu in conformitate cu lit. B pct. 2 c) si partea I cap. III art. 14.

    C. Alte tehnici de diagnostic
    1. Lichidul supernatant preparat astfel cum este indicat in partea I cap. II art. 9 poate fi supus unor tehnici de IFAT sau ELISA, in conformitate cu partea I cap. IV art. 17 - 18.
    2. Aceste tehnici rapide trebuie sa fie completate printr-un examen virusologic in 48 de ore dupa prelevare, in conformitate cu lit. A sau B, daca:
    a) a fost obtinut un rezultat negativ;
    sau
    b) a fost obtinut un rezultat negativ de la o prelevare reprezentand primul caz de NHI sau SHV intr-o zona agreata.
    3. Materialul tisular poate fi supus si altor tehnici de diagnostic cum ar fi RT - PCR, IF pe sectiuni congelate sau imunohistochimie pe material tisular fixat in formol.
    4. Aceste tehnici trebuie sa fie intotdeauna insotite de inoculare pe culturi celulare de material tisular nefixat.

    PARTEA a III-a
    Demonstrarea absentei anterioare de SHV si/sau NHI in zone sau ferme din zone neagreate

    Art. 22
    Linii directoare si criterii care se aplica unui program de inspectii sanitare veterinare oficiale
    (1) Un program de inspectii sanitare veterinare poate fi pus in aplicare doar in urmatoarele situatii:
    a) dupa un program de eradicare a SHV si/sau NHI recunoscut oficial, care sa cuprinda eliminarea tuturor pestilor din unitate, curatenie mecanica, dezinfectie si lasarea pe uscat inainte de repopularea cu pesti din unitati agreate;
    sau
    b) in unitati piscicole in care nu a evoluat anterior nici o infectie legata de virusul SHV sau NHI.
    (2) Programul de inspectii sanitare veterinare oficiale trebuie sa se bazeze pe examinari clinice si examene de laborator.
    (3) Programul trebuie sa cuprinda doua inspectii sanitare veterinare clinice anuale, in conformitate cu cele indicate in partea I.
    (4) Cel putin la una dintre inspectiile anuale, la fiecare dintre unitati se preleveaza 30 de probe de tesut de peste si/sau lichid ovarian. Probele sunt selectate, prelucrate si supuse unui examen de laborator in conformitate cu cele prevazute in partea I cap. II si IV.
    (5) Programul de inspectii sanitare veterinare trebuie sa fie aplicat pentru cel putin 4 ani in toate unitatile din zona sau intr-o unitate dintr-o zona neagreata, destinata sa fie agreata.
    (6) Pentru ca un program sa fie recunoscut oficial, nu trebuie sa se produca sau sa fie detectat nici un caz de SHV sau NHI, nici ca infectie clinica, nici in urma unei izolari virale.

    PARTEA a IV-a
    Titrarea destinata verificarii sensibilitatii culturilor celulare la infectie

    Art. 23
    Procedurile recomandate pentru titrarea la care se face referire in partea I cap. III art. 12 sunt prezentate in continuare.
    Art. 24
    Este necesar sa se utilizeze cel putin doua tulpini de virus SHV si o tulpina de virus NHI. Tulpinile trebuie sa fie reprezentative pentru principalele tulpini virale din Uniunea Europeana, de exemplu, in ceea ce priveste virusul SHV, o tulpina patogena provenind de la pastravul curcubeu din apa dulce si o tulpina patogena din mediul marin pentru calcan, iar in ceea ce priveste virusul NHI, o tulpina patogena pentru pastravul curcubeu provenind din Europa. Este necesar sa se utilizeze tulpini virale bine definite provenind din statele membre ale Uniunii Europene.
    Art. 25
    Tulpinile de referinta sunt disponibile in laboratoarele de referinta ale Uniunii Europene pentru bolile pestilor.
    Art. 26
    Loturile de virus avand un numar redus de pasaje pe culturi celulare sunt cultivate in flacoane de culturi celulare pe liniile BF2 sau RTG2 pentru virusul SHV si pe linia celulara EPC pentru virusul NHI. Trebuie sa se utilizeze un mediu de cultura la care sa se adauge cel putin 10% ser fetal. Este necesar sa se utilizeze un indicator MOI, iar raportul dintre numarul de particule virale infectioase ce se adauga la un numar cunoscut de celule dintr-o cultura sa fie sub 1.
    Art. 27
    Atunci cand efectul citopatic este total, virusul din supernatant este colectat prin centrifugarea culturilor celulare la 2000 x g pentru 15 minute, sterilizat prin filtrare printr-un filtru de membrana de 0,45 micrometri si distribuit in criotuburi notate. Virusul este pastrat la o temperatura de -80 grade C.
    Art. 28
    La o saptamana dupa inghetare 3 criotuburi cu cate o tulpina virala fiecare sunt dezghetate in apa rece si titrate pe liniile celulare sensibile. Cel putin la fiecare 6 luni, sau daca susceptibilitatea liniilor celulare se banuieste ca a scazut, fiecare tulpina virala este dezghetata si titrata.
    Art. 29
    Procedura de titrare trebuie sa fie descrisa in detaliu pentru ca aceeasi procedura sa fie urmata de fiecare data.
    Art. 30
    Titrarea prin dilutie limita trebuie sa cuprinda cel putin 6 replicari de fiecare serie de dilutie. Titrurile sunt comparate cu titrurile obtinute anterior. Daca titrul uneia dintre cele 3 tulpini virale scade cu un factor de 2 log sau mai mult, in raport cu titrul initial, linia celulara nu mai trebuie sa fie utilizata in scop de supraveghere.
    Art. 31
    Daca liniile celulare sunt conservate in laborator, fiecare linie trebuie sa fie examinata separat.
    Art. 32
    Registrele cu evidentele de laborator trebuie sa fie pastrate cel putin 10 ani.

    PARTEA a V-a
    Acronime si abrevieri

    BF2       Bluegill fry (linie celulara)
    ECP       Efect citopatic
    CRL       Laborator de referinta al Comunitatii Europene pentru bolile
              pestilor
    ELISA     Test imunoenzimatic
    EPC       Epithelioma papulosum cyprini (linie celulara)
    FHM       Fathead minnow (linie celulara)
    FITC      Fluorescein izotiocianat
    Hepes     Acid N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etan sulfonic
    HRP       Peroxidaza din hrean
    IF        Imunofluorescenta
    IFAT      Test de imunofluorescenta indirecta
    NHI       Necroza hematopoietica infectioasa
    NPI       Necroza pancreatica infectioasa
    MEM       Mediu minim esential
    MOI       Multiplicity of infection (raportul dintre numarul de particule
              virale infectioase adaugate la un numar cunoscut de celule din
              cultura)
    OPD       Ortho phenilen diamine
    PBS       Tampon fosfat salin
    RTG2      Rainbow trout gonad (linie celulara)
    RT-PCR    Reversed transcriptase polymerase chain reaction
    Tris-HCI  Tris-hidroximetil-aminometan-HCI
    TRITC     Tetrametil-rodamin-izotiocianat
    SHV       Septicemia hemoragica virala

    Art. 33
    Anexele nr. 1, 2 si 3 fac parte integranta din prezenta norma sanitara veterinara.

    ANEXA 1
    la norma sanitara veterinara

                              Tabelul 1 A
    Schema de inspectie si recoltare pentru zonele si fermele din zonele neagreate pentru o perioada de control de doi ani care preceda obtinerea statutului de agreare pentru SHV si/sau NHI

 ______________________________________________________________________________
|                       |   Numarul  |   Numarul  |   Examenele de laborator   |
|                       |inspectiilor|examinarilor| pentru prezenta de virus*1)|
|                       | clinice pe |de laborator|____________________________|
|                       | an/doi ani |  pe an/doi |  Numarul de |  Numarul de  |
|                       |            |     ani    |   pesti de  |reproducatori/|
|                       |            |            |   diferite  |fluid ovarian |
|                       |            |            |marimi/organe|              |
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|Zone si ferme          |            |            |             |              |
|continentale:          |            |            |             |              |
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|a) Ferme               |      2     |      2     |120 - prima  |30 - prima    |
|   cu reproducatori    |            |            |inspectie*2) |inspectie*3)  |
|                       |            |            |150 - a doua |0 - a doua    |
|                       |            |            |inspectie    |inspectie*3)  |
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|b) Ferme doar          |      2     |      1     |      0      |150 - prima   |
|   cu reproducatori    |            |            |             |sau a doua    |
|                       |            |            |             |inspectie*3)  |
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|c) Ferme fara          |      2     |      2     |150 - prima  |      0       |
|   reproducatori       |            |            |si a doua    |              |
|                       |            |            |inspectie    |              |
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|Zone si ferme costiere:|            |            |             |              |
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|a) Ferme               |      2     |      2     |120 - prima  |30 - prima    |
|   cu reproducatori    |            |            |inspectie    |inspectie*3)  |
|                       |            |            |150 - a doua |0 - a doua    |
|                       |            |            |inspectie    |inspectie*3)  |
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|b) Ferme de salmonide  |      2     |      2     |30 - prima   |      0       |
|   fara reproducatori  |            |            |si a doua    |              |
|                       |            |            |inspectie*4) |              |
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|c) Ferme cu specii de  |      2     |      2     |150 - prima  |      0       |
|   pesti, altele decat |            |            |si a doua    |              |
|   salmonide, fara     |            |            |inspectie    |              |
|   reproducatori       |            |            |             |              |
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|

    Numar maxim de pesti/pool: 10.
------------
    *1) O proba cu numar redus de pesti, conform tabelului 1B, se poate recolta daca sunt indeplinite prevederile descrise in textul partii a II-a si a III-a din prezenta norma sanitara veterinara.
    *2) Inspectii clinice.
    *3) In circumstante exceptionale, daca este imposibil sa se obtina lichid ovarian, se vor recolta organe.
    *4) Probele nu trebuie sa fie colectate mai devreme de 3 saptamani dupa transferul pestilor din apa dulce in apa marina.

    ANEXA 2
    la norma sanitara veterinara

                                Tabelul 1 B
Schema de inspectie si recoltare pentru o perioada de control de doi ani care preceda obtinerea statutului de agreare pentru SHV si/sau NHI in zone si ferme din zone neagreate, pentru care absenta anterioara a bolilor a fost oficial dovedita

 ______________________________________________________________________________
|                       |   Numarul  |   Numarul  |   Examenele de laborator   |
|                       |inspectiilor|examinarilor|  pentru prezenta de virus  |
|                       | clinice pe |de laborator|____________________________|
|                       | an/doi ani |  pe an/doi |  Numarul de |  Numarul de  |
|                       |            |     ani    |   pesti de  |reproducatori/|
|                       |            |            |   diferite  |fluid ovarian |
|                       |            |            |marimi/organe|              |
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|Zone si ferme          |            |            |             |              |
|continentale:          |            |            |             |              |
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|a) Ferme               |      2     |      2     |0 - prima    |30 - prima    |
|   cu reproducatori    |            |            |inspectie*1) |inspectie*2)  |
|                       |            |            |30 - a doua  |0 - a doua    |
|                       |            |            |inspectie    |inspectie     |
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|b) Ferme doar          |      2     |      1     |      0      |30 - prima    |
|   cu reproducatori    |            |            |             |sau a doua    |
|                       |            |            |             |inspectie*2)  |
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|c) Ferme fara          |      2     |      2     |30 - prima   |      0       |
|   reproducatori       |            |            |si a doua    |              |
|                       |            |            |inspectie    |              |
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|Zone si ferme costiere:|            |            |             |              |
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|a) Ferme               |      2     |      2     |0 - prima    |30 - prima    |
|   cu reproducatori    |            |            |inspectie    |inspectie*2)  |
|                       |            |            |30 - a doua  |0 - a doua    |
|                       |            |            |inspectie    |inspectie     |
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|b) Ferme de salmonide  |      2     |      2     |30 - prima   |      0       |
|   fara reproducatori  |            |            |si a doua    |              |
|                       |            |            |inspectie*3) |              |
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|c) Ferme cu specii de  |      2     |      2     |30 - prima   |      0       |
|   pesti, altele decat |            |            |si a doua    |              |
|   salmonide, fara     |            |            |inspectie    |              |
|   reproducatori       |            |            |             |              |
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|

    Numar maxim de pesti/pool: 10.
------------
    *1) Inspectii clinice.
    *2) In situatii exceptionale, daca este imposibil sa se obtina lichid ovarian, se pot recolta organe.
    *3) Probele nu trebuie sa fie recoltate mai devreme de 3 saptamani dupa transferul pestilor din apa dulce in apa marina.

    ANEXA 3
    la norma sanitara veterinara

                                Tabelul 1 C
Schema de inspectie si recoltare pentru zonele si fermele din zone neagreate in scopul mentinerii statutului de agreare pentru SHV si/sau NHI

 ______________________________________________________________________________
|                              |   Numarul  |   Numarul de pesti in grupa de   |
|                              |inspectiilor|   esantionare pentru examinare   |
|                              | clinice pe |          de laborator*1)         |
|                              | an/doi ani |__________________________________|
|                              |            |Numarul de pesti|    Numarul de   |
|                              |            |   de diferite  |  reproducatori/ |
|                              |            |  marimi/organe |  fluid ovarian  |
|______________________________|____________|________________|_________________|
|Zone si ferme continentale:   |            |                |                 |
|______________________________|____________|________________|_________________|
|a) Ferme cu reproducatori     |      2     |20 - prima sau a|10 - prima sau a |
|                              |            |doua inspectie  |doua inspectie*2)|
|______________________________|____________|________________|_________________|
|b) Ferme doar cu reproducatori|      2     |         0      |30 - prima sau a |
|                              |            |                |doua inspectie*2)|
|______________________________|____________|________________|_________________|
|c) Ferme fara reproducatori   |      2     |        30      |         0       |
|______________________________|____________|________________|_________________|
|Zone si ferme costiere:       |            |                |                 |
|______________________________|____________|________________|_________________|
|a) Ferme cu reproducatori     |      2     |20 - prima sau a|10 - prima sau a |
|                              |            |doua inspectie  |doua inspectie*2)|
|______________________________|____________|________________|_________________|
|b) Ferme fara reproducatori   |      1     |        30*3)   |         0       |
|______________________________|____________|________________|_________________|

    Numar maxim de pesti/pool: 10.
------------
    *1) In zonele agreate probele trebuie sa fie recoltate doar prin rotatie la 50% din ferme in fiecare an. In fermele agreate din zonele neagreate trebuie sa fie recoltate in fiecare an.
    *2) In situatii exceptionale, daca este imposibil sa se obtina lichid ovarian, se pot recolta organe.
    *3) Probele nu trebuie sa fie recoltate mai devreme de 3 saptamani dupa transferul pestilor din apa dulce in apa marina.