ORDIN
Nr. 471 din 10 octombrie 2002
pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind planurile de prelevare,
metodele de diagnostic, determinarea si confirmarea prezentei septicemiei
hemoragice virale - SHV - si necrozei hematopoetice infectioase - NHI - la
pesti
ACT EMIS DE: MINISTERUL AGRICULTURII, ALIMENTATIEI SI PADURILOR
ACT PUBLICAT IN: MONITORUL OFICIAL NR. 857 din 27 noiembrie 2002
In temeiul prevederilor art. 31 alin. 1 din Legea sanitara veterinara nr.
60/1974, republicata, cu modificarile si completarile ulterioare,
in baza Hotararii Guvernului nr. 362/2002 privind organizarea si
functionarea Ministerului Agriculturii, Alimentatiei si Padurilor, cu
modificarile si completarile ulterioare,
vazand Referatul de aprobare nr. 159.465 din 16 septembrie 2002, intocmit
de Agentia Nationala Sanitara Veterinara,
ministrul agriculturii, alimentatiei si padurilor emite urmatorul ordin:
Art. 1
Se aproba Norma sanitara veterinara privind planurile de prelevare,
metodele de diagnostic, determinarea si confirmarea prezentei septicemiei
hemoragice virale - SHV - si necrozei hematopoetice infectioase - NHI - la
pesti, prevazuta in anexa care face parte integranta din prezentul ordin.
Art. 2
Agentia Nationala Sanitara Veterinara, institutele centrale de profil si
directiile sanitare veterinare judetene si a municipiului Bucuresti vor aduce
la indeplinire prevederile prezentului ordin.
Art. 3
Agentia Nationala Sanitara Veterinara va controla modul de aplicare a
prevederilor prezentului ordin.
Art. 4
La data intrarii in vigoare a prezentului ordin se abroga orice alta
dispozitie contrara.
Art. 5
Prezentul ordin va fi publicat in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I.
Ministrul agriculturii, alimentatiei si padurilor,
Ilie Sarbu
ANEXA 1
NORMA SANITARA VETERINARA
privind planurile de prelevare, metodele de diagnostic, determinarea si confirmarea
prezentei septicemiei hemoragice virale - SHV - si necrozei hematopoetice
infectioase - NHI - la pesti
PREVEDERI GENERALE
Art. 1
In sensul prezentei norme sanitare veterinare, se prevad:
a) liniile directoare si reglementarile minime care se aplica planurilor de
prelevare si metodelor de diagnostic pentru detectarea si confirmarea prezentei
septicemiei hemoragice virale - SHV - si necrozei hematopoetice infectioase -
NHI;
b) integrarea dispozitiilor Ordinului ministrului agriculturii,
alimentatiei si padurilor nr. 494/2001 pentru aprobarea Normei sanitare
veterinare privind conditiile de sanatate a animalelor, care reglementeaza
punerea pe piata a animalelor si a produselor de acvacultura, publicat in
Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I, nr. 191 din 21 martie 2002, cu privire
la agrearea si mentinerea agrearii zonei si a unitatilor in zonele neagreate;
c) stabilirea dispozitiilor care vizeaza diagnosticul corect al SHV si NHI
si recunoasterea oficiala a statutului de zona agreata si unitate agreata in
zona neagreata, in conformitate cu Ordinul ministrului agriculturii,
alimentatiei si padurilor nr. 494/2001;
d) stabilirea conduitei autoritatilor responsabile cu controlul SHV si NHI
si personalului de laborator care realizeaza testele pentru aceste boli. In
consecinta, accentul este pus pe procedurile de prelevare, principiile si
aplicatiile testelor de laborator si evaluarea rezultatului acestora, precum si
pe tehnicile de laborator in detaliu. Totusi, la nevoie, laboratoarele pot sa
aduca modificari la testele descrise in aceasta anexa sau sa utilizeze teste
diferite, cu conditia sa fie dovedite o sensibilitate si o specificitate
echivalente. Partea I cuprinde planurile de prelevare si metodele de diagnostic
pentru supravegherea SHV si NHI cu scopul de a obtine mentinerea statusului de
zona agreata sau unitate agreata in zona neagreata. Partea a II-a descrie
procedeele de diagnostic pentru confirmarea SHV si NHI in caz de suspiciune.
Partea a III-a cuprinde criteriile si liniile directoare aplicabile unui
program de inspectie sanitara veterinara oficiala care sa dovedeasca absenta
anterioara a SHV si/sau NHI. Partea a IV-a furnizeaza recomandari asupra
procedurilor de titrare a virusurilor NHI si SHV in scopul verificarii
sensibilitatii culturilor celulare la infectie. In partea a V-a sunt enumerate
acronimele si abrevierile.
PARTEA I
Planurile de prelevare si metodele de diagnostic pentru supravegherea
septicemiei hemoragice virale - SHV - si necrozei hematopoetice infectioase -
NHI - la pesti pentru obtinerea si mentinerea agrearii unei zone sau unei
unitati dintr-o zona neagreata
CAP. 1
Inspectii si prelevare
Art. 2
Dispozitii generale relative la inspectiile sanitare veterinare clinice, la
colectarea si selectionarea probelor pentru supravegherea zonelor sau
unitatilor situate in zone neagreate, in scopul obtinerii sau mentinerii
agrearii pentru SHV si/sau NHI
a) Inspectiile sanitare veterinare clinice si prelevarile de tesuturi de
peste si/sau lichid ovarian se efectueaza in zone sau unitati situate in zone
neagreate, in vederea obtinerii sau mentinerii agrearii pentru SHV si/sau NHI,
in conformitate cu Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si padurilor
nr. 494/2001. Alte detalii sunt prezentate in art. 3 - 5. Schemele de inspectie
si recoltare prevazute in anexele nr. 1 si 2 nu se aplica unor unitati noi sau
unitatilor care acum incep activitatea cu peste, icre sau lapti care provin din
zone agreate sau din unitati agreate situate in zone neagreate, cu conditia ca
ele sa indeplineasca cerintele prevazute in Ordinul ministrului agriculturii,
alimentatiei si padurilor nr. 494/2001.
b) Inspectiile clinice trebuie sa fie efectuate in cursul perioadei
cuprinse intre lunile octombrie si iunie sau cand temperatura apei este
inferioara celei de 14 grade C. Atunci cand unitatile trebuie sa faca obiectul
unei inspectii clinice de doua ori pe an, intervalele dintre inspectii trebuie
sa fie de cel putin 4 luni. Toate unitatile de productie (bazine, cuve, viviere
etc.) trebuie sa fie supuse unei inspectii destinate sa stabileasca prezenta de
pesti morti, agonici sau cu comportament anormal. O atentie particulara trebuie
sa fie acordata punctului de evacuare a apei, unde pestii agonici au tendinta
sa se acumuleze in curentul de apa.
c) Pestii care se preleveaza sunt selectionati dupa cum urmeaza:
1. daca sunt prezenti pastravi curcubeu, singurii care se preleveaza sunt
acestia; daca acestia nu sunt prezenti, prelevarea se compune din toate
speciile prezente, in masura in care aceste specii sunt sensibile la virusurile
SHV si/sau NHI si in conformitate cu Ordinul ministrului agriculturii,
alimentatiei si padurilor nr. 494/2001; in proba speciile trebuie sa fie
reprezentate proportional;
2. daca mai mult de o sursa de apa este utilizata pentru productia de
peste, in proba prelevata trebuie sa fie inclusi pestii care sa reprezinte
toate sursele de apa;
3. daca sunt pesti in agonie, cu comportament anormal sau pesti morti
recent, dar nu descompusi, acestia trebuie selectionati in primul rand; daca
acesti pesti nu sunt prezenti, proba prelevata trebuie sa fie compusa din pesti
cu aspect anormal, aparent sanatosi, din toate zonele din unitate, astfel ca
toate clasele de varsta sa fie reprezentate proportional in proba.
Art. 3
Dispozitii specifice, incluzand colectarea probelor, relative la
supravegherea zonelor sau unitatilor din zonele neagreate, in scopul obtinerii
agrearii pentru SHV si/sau NHI
a) O zona sau o exploatatie dintr-o zona neagreata, plasata sub controlul
serviciilor sanitare veterinare, poate obtine agrearea pentru SHV si/sau NHI cu
conditia sa se supuna unuia dintre urmatoarele doua programe:
1. Modelul A - Program de supraveghere pentru 2 ani. Dupa cel putin 2 ani
de absenta a unui semn clinic de SHV si/sau NHI, toate unitatile dintr-o zona
sau orice unitate dintr-o zona neagreata destinata agrearii trebuie sa faca
obiectul unei inspectii sanitare veterinare de doua ori pe an, timp de 2 ani.
In timpul acestei perioade de control de 2 ani care precede obtinerea agrearii,
absenta oricarui semn clinic de SHV si/sau NHI trebuie sa fie continua, iar
prelevarile de probe sa se efectueze in conformitate cu anexa nr. 1. In plus,
probele trebuie sa fie selectionate, prelucrate si examinate conform
dispozitiilor art. 2 - 5, iar examenele de laborator trebuie sa fie negative
pentru SHV si/sau NHI;
sau
2. Modelul B - Program de supraveghere pentru 2 ani, cu o marime redusa a
probei prelevate. Ca urmare a unui program de inspectii sanitare veterinare
oficiale care poate dovedi absenta SHV si/sau NHI pentru cel putin 4 ani, toate
unitatile din zona sau orice unitate dintr-o zona neagreata, destinata
agrearii, trebuie sa faca obiectul unei inspectii sanitare veterinare de doua
ori pe an, timp de 2 ani. In cursul acestei perioade care preceda obtinerea
agrearii, absenta semnelor clinice sau a altor semne de SHV si/sau NHI trebuie
sa fie continua, iar probele se preleveaza pentru examen in conformitate cu
anexa nr. 2. In plus, prelevarile trebuie sa fie selectionate, pregatite si
examinate conform dispozitiilor art. 2 - 5, iar examenele de laborator sa fie
negative pentru SHV si/sau NHI.
Pentru ca un program de inspectii sanitare veterinare sa fie recunoscut de
catre serviciile sanitare oficiale ca facand dovada absentei anterioare a SHV
si/sau NHI, trebuie sa indeplineasca si sa respecte criteriile stabilite in
partea a III-a.
b) Dispozitii speciale sunt aplicabile in unitatile nou-agreate si in
unitatile care incep activitatea cu pesti, icre sau lapti provenind dintr-o
zona agreata sau dintr-o unitate agreata dintr-o zona neagreata.
Unitatile noi sau unitatile care isi incep activitatea cu pesti, icre sau
lapti provenind dintr-o zona agreata sau unitate agreata din zona neagreata pot
obtine agrearea in conformitate cu Ordinul ministrului agriculturii,
alimentatiei si padurilor nr. 494/2001. In consecinta, dispozitiile de
prelevare sunt stabilite in conformitate cu modelele A si B prevazute la lit.
a) de mai sus.
Art. 4
Program de supraveghere pentru mentinerea agrearii pentru SHV si/sau NHI
In scopul mentinerii agrearii intr-o zona sau intr-o unitate dintr-o zona
neagreata pentru SHV si/sau NHI, inspectiile si prelevarea probelor pentru
examen trebuie sa se efectueze in conformitate cu anexa nr. 3. Probele trebuie
sa fie selectionate, pregatite si examinate in conformitate cu dispozitiile
art. 2 - 5, iar rezultatele examenelor de laborator sa fie negative pentru SHV
si/sau NHI.
Art. 5
Pregatirea si expedierea probelor de peste
a) Inainte de a fi expediate sau transferate catre laborator, se preleveaza
de la pesti organe sau fragmente de organe cu ajutorul instrumentelor de
disectie si se transfera in tub de plastic steril continand mediu de transport
- mediu de culturi celulare cu 10% ser fetal bovin si antibiotice. Se recomanda
combinatia de 200 UI penicilina, 200 micrograme streptomicina si 200 micrograme
kanamicina/ml, dar in aceeasi masura pot fi utilizate si alte antibiotice cu
eficacitate demonstrata. Tesuturile pentru examinat sunt splina, rinichiul
anterior si, dupa caz, cordul sau encefalul. In anumite cazuri trebuie examinat
lichidul ovarian, in conformitate cu anexele nr. 1 - 3. Lichidul ovarian sau
fragmente de organe de la maximum 10 pesti - anexele nr. 1 - 3 - pot fi
comasate intr-un tub steril continand 4 ml mediu de transport si care sa
reprezinte un esantion (pool) global. Tesuturile din fiecare pool trebuie sa
fie in cantitate de cel putin 0,5 g.
b) Tuburile cu probe se introduc intr-un recipient izolat, de exemplu o
cutie de polistiren cu peretii grosi, cu o cantitate suficienta de gheata, care
sa garanteze refrigerarea probelor pe timpul transportului pana la laborator.
Trebuie evitata congelarea probelor. Temperatura probei pe timpul transportului
nu trebuie sa depaseasca 10 grade C, recipientul de transport trebuie sa mai
contina gheata cand ajunge la destinatie, iar blocul refrigerator trebuie sa
fie partial sau total congelat.
c) Examenul virusologic trebuie sa inceapa imediat sau cat mai curand
posibil, cel tarziu in 48 de ore de la prelevarea probelor. In cazuri
exceptionale, de exemplu atunci cand pestii provin din zone indepartate, fara
posibilitate de expediere zilnica, examenul virusologic poate fi efectuat in 72
de ore de la colectarea materialului de examinat, cu conditia ca acesta sa fie
protejat cu mediu de transport, iar conditiile de temperatura pe timpul
transportului sa fie cele indicate mai sus. Se pot expedia si pesti vii.
Conditiile de ambalare si etichetare trebuie sa respecte reglementarile
nationale sau internationale in vigoare in materie de transport, daca este
cazul.
Art. 6
Colectarea de material suplimentar pentru diagnostic
De comun acord cu Institutul de Diagnostic si Sanatate Animala, si alte
probe pot fi colectate si pregatite in vederea examenelor suplimentare.
CAP. 2
Prepararea probelor in vederea examenului virusologic
Art. 7
Congelarea in cazuri exceptionale
Daca exista dificultati obiective, precum conditii climaterice
defavorabile, zile nelucratoare, probleme de laborator, care impiedica
inocularea celulelor in primele 48 de ore de la colectarea probelor de tesut,
este admis ca probele sa fie congelate in mediu de cultura la -20 grade C sau
la o temperatura inferioara, iar examenul virusologic sa se efectueze intr-o
perioada de 14 zile. Totusi proba nu poate fi congelata si decongelata decat o
singura data inaintea examinarii. Este necesar sa se tina un registru in care
sa fie mentionate cauzele fiecarei congelari a probelor de tesut, de exemplu
furtuni, linii celulare moarte etc.
Art. 8
Omogenizarea organelor
In laborator, tesuturile trebuie sa fie complet omogenizate cu ajutorul
unui stomaker sau cu mojar si nisip steril, dupa care produsul se introduce in
mediul de transport original. Daca proba este compusa din pesti intregi mai
mici de 4 cm lungime, acestia se fragmenteaza cu foarfecele steril dupa ce se
elimina coada din spatele anusului. Daca proba este constituita din pesti cu
dimensiuni de 4 - 6 cm, se colecteaza viscerele si rinichiul. Daca pestii sunt
mai mari de 6 cm, tesuturile se recolteaza conform prevederilor cap. I art. 4.
Probele de tesut se reduc la fragmente mici cu ajutorul foarfecelui steril sau
bisturiului, se omogenizeaza si se introduc in mediul de transport, asa cum s-a
mentionat mai sus. Raportul final intre materialul tisular si mediul de
transport trebuie sa fie de 1:10.
Art. 9
Centrifugarea omogenatului
a) Omogenatul este centrifugat in centrifuga cu racire, la o temperatura
cuprinsa intre 2 - 5 grade C la 2.000 - 4.000 x g, timp de 15 minute, iar
lichidul supernatant este colectat si tratat, fie 4 ore la 15 grade C, fie
peste noapte la 4 grade C, cu antibiotice; de exemplu, 1 mg gentamicina/ml
poate fi foarte util in acest stadiu. Daca proba a fost expediata in mediu de
transport - adica sub antibiotic -, tratamentul lichidului supernatant nu mai
este necesar. Tratamentul cu antibiotic vizeaza impiedicarea contaminarii
bacteriene a probei si face inutila filtrarea prin filtru cu membrana. Daca
lichidul supernatant colectat este congelat la -80 grade C in curs de 48 de ore
de la prelevarea probei, acesta poate fi utilizat o singura data pentru examen
virusologic.
b) Daca exista dificultati obiective - incubator defect, probleme cu
mediile de cultura celulare - care impiedica inocularea celulelor in primele 48
de ore de la prelevarea probelor de tesut, este admis ca lichidul supernatant
sa fie congelat la -80 grade C, iar examenul virusologic sa fie executat in
maximum 14 zile. Inainte de a inocula celulele, se amesteca supernatantul cu
parti egale cu un pool de antiser contra serotipurilor indigene de virus al
necrozei pancreatice infectioase - NPI -, diluat intr-o maniera adecvata si
incubat timp de minimum o ora la 15 grade C sau maximum 18 ore la 4 grade C.
Titrul antiserului trebuie sa fie cel putin 1/2.000 intr-un test de
neutralizare a plajelor cu 50% - reducerea plajelor. Tratamentul efectuat prin
inocularea cu ser antivirus NPI la culturile celulare - virus care in anumite
regiuni din Europa este prezent in 50% din probele de peste - vizeaza
impiedicarea aparitiei unui efect citopatic dat de NPI in respectivele culturi
celulare. Acest tratament permite reducerea duratei examenului virusologic, astfel
ca numarul de cazuri in care apare efectul citopatic sa fie considerat ca un
indicator potential de SHV si/sau NHI. Atunci cand probele provin dintr-o
unitate considerata indemna la NPI, tratamentul cu ser antivirus NPI poate fi
omis.
CAP. 3
Examinarea virusologica
Art. 10
Culturile celulare si mediile de cultura
a) Linii celulare Bluegill fry - BF2 - sau Rainbow trout gonad - RTG2 - si
Epithelioma papulosum cyprini - EPC - sau Fathead minnow - FHM - sunt crescute
la temperaturi de 20 - 30 grade C in mediu corespunzator, de exemplu Eagle's
MEM sau modificari ale acestuia, cu un supliment de ser fetal bovin de 10% si
antibiotice in concentratii standard.
b) Cand celulele sunt cultivate in sisteme inchise, este recomandat ca
mediul sa fie tamponat cu bicarbonat de sodiu. Mediul folosit pentru cultivarea
celulelor in sisteme deschise poate fi tamponat cu Trishidroximetil aminometan
- Tris-HCI, 23 mM si bicarbonat de sodiu, 6 mM; pH-ul trebuie sa fie 7,6 +/-
0,2.
c) Culturile celulare folosite pentru inocularea cu omogenat de tesuturi
trebuie sa fie tinere, 4 - 48 de ore, si in faza de crestere, neconfluente, la
inoculare.
Art. 11
Inocularea culturilor celulare
a) Suspensia de organe tratata cu antibiotice este inoculata pe culturi
celulare in doua dilutii, de exemplu dilutia primara si in plus o dilutie de
1:10 din aceasta, rezultand dilutii finale ale omogenatului de organe in mediul
de culturi celulare de 1:100 si, respectiv, 1:1.000, in scopul prevenirii
interferentei omologilor. Cel putin doua linii celulare trebuie sa fie
inoculate in conformitate cu prevederile art. 10 lit. a). Raportul dintre
volumul inoculului - suspensia de organe tratata cu antibiotice - si volumul
mediului de culturi celulare trebuie sa fie de aproximativ 1:10.
b) Pentru fiecare dilutie si fiecare linie celulara trebuie sa fie
utilizata o suprafata de aproximativ 2 cm^2, corespunzand unui godeu dintr-o
placa cu 24 de godeuri. Folosirea placutelor cu godeuri este recomandata, dar
sunt acceptate, de asemenea, si alte suporturi cu suprafata de crestere
similara sau mai mare.
Art. 12
Incubarea culturilor celulare
a) Culturile celulare inoculate sunt incubate la temperatura de 15 grade C
pentru 7 - 10 zile. Daca culoarea mediului culturilor celulare vireaza de la
rosu la galben, indicand o acidifiere a mediului, se va ajusta pH-ul mediului
cu solutie sterila de bicarbonat de sodiu sau substante echivalente, pentru a
asigura susceptibilitatea culturii celulare la infectie.
b) La fiecare 6 luni sau daca este suspectata scaderea susceptibilitatii
celulare, se va efectua calcularea titrului stocurilor de virusuri inghetate
pentru SHV si NHI, pentru a verifica susceptibilitatea culturilor celulare la
infectie. O procedura recomandata este prezentata in partea a IV-a.
Art. 13
Microscopia
Culturile celulare inoculate trebuie sa fie inspectate zilnic sau cel putin
de trei ori pe saptamana, cu scopul de a urmari aparitia efectului citopatic,
cu un grosisment intre 40 x la 150 x. Daca efectul citopatic este evident, se
incepe imediat procedura de identificare a virusului in conformitate cu partea
I cap. IV.
Art. 14
Subcultivarea
a) Daca nu se produce nici un efect citopatic in prima incubatie de 7 - 10
zile, se procedeaza la o subcultivare pe culturi celulare proaspete,
utilizandu-se o suprafata celulara similara cu cea din cultura primara.
b) Cantitatea de mediu - lichid supernatant - care provine din toate
culturile/godeurile ce constituie cultura primara este adunata intr-un pool
pentru fiecare linie celulara, la 7 - 10 zile dupa inoculare. Esantioanele -
pool-urile - sunt apoi inoculate pe culturi celulare omoloage, nediluat si
diluat 1/10, rezultand in final dilutii ale supernatantului de 1:10 si 1:100,
astfel cum este descris in art. 11. Parti de 10% din mediul ce constituie
cultura primara sunt inoculate direct intr-un godeu cu culturi celulare
proaspete, subcultivare godeu la godeu. Inocularea poate fi precedata de o
preincubare a dilutiilor cu antiser contra virusului NPI in dilutii
corespunzatoare, in conformitate cu cap. II art. 9.
c) Incubarea urmatoare, timp de 7 - 10 zile la 15 grade C, se face in
conformitate cu art. 12.
d) Daca se produce un efect citopatic toxic in primele 3 zile de incubatie,
se poate realiza o subcultivare in acest stadiu, dar celulele trebuie sa fie
incubate 7 zile, urmata de o subcultivare cu durata de incubatie tot de 7 zile.
Atunci cand se produce un efect citopatic toxic dupa 3 zile, celulele pot fi
pasate o data si incubate pentru a obtine un total de 14 zile de la prima
inoculare. Nu trebuie sa existe semne de toxicitate in cursul ultimelor 7 zile
de incubatie.
e) Daca se produce o contaminare bacteriana in ciuda tratamentului cu
antibiotice, subcultivarea trebuie precedata de o centrifugare la 2.000 - 4.000
x g timp de 15 - 30 de minute, la temperatura de 2 - 5 grade C, si/sau de o
filtrare a supernatantului cu un filtru - membrana cu procent scazut de
absorbtie a proteinei - de 0,45 micrometri. In plus fata de acest aspect,
procedurile de subcultivare sunt aceleasi ca si cele care se aplica in cazul
aparitiei efectului citopatic toxic.
CAP. 4
Identificarea virusului
Art. 15
Teste de identificare virala
Daca se observa aparitia de efect citopatic in culturile celulare, mediul
de cultura - supernatantul - este colectat si examinat prin una dintre
urmatoarele tehnici: neutralizare, imunofluorescenta, ELISA.
Daca prin aceste teste nu se definitiveaza identificarea virusului intr-o
saptamana, supernatantul trebuie sa fie trimis la un laborator national de
referinta sau la laboratorul de referinta al Uniunii Europene pentru bolile
pestilor, in vederea identificarii imediate.
Art. 16
Neutralizarea
a) Se indeparteaza celulele din supernatantul colectat, prin centrifugare
la 2.000 - 4.000 x g sau filtrare prin membrana de 0,45 micrometri cu procent
scazut de absorbtie a proteinelor, si se dilueaza supernatantul 1:100 si
1:10.000 in mediu de culturi celulare.
b) Parti din cele doua dilutii ale supernatantului sunt amestecate separat
si incubate pentru 60 de minute la 15 grade C cu parti egale din urmatorii
reagenti:
1. ser ce contine anticorpi anti virusul SHV la dilutie 1:50, vol:vol;
2. ser ce contine anticorpi anti virusul IHN la dilutie 1:50, vol:vol;
3. pool de antiser anti serotipurile indigene la virusul IPN la dilutie
1:50, vol:vol;
4. doar mediu - martor pozitiv.
c) 50 microlitri din fiecare amestec format din supernatantul cu virusul de
identificat si ser se inoculeaza pe cel putin doua culturi celulare si se
incubeaza la 15 grade C. Se urmareste aparitia efectului citopatic asa cum este
descris in art. 13.
d) Unele tulpini de virus SHV nu reactioneaza la testele de neutralizare.
Astfel de izolate trebuie sa fie identificate prin imunofluorescenta - IF - sau
ELISA.
e) Pot fi utilizate alternativ si alte teste de neutralizare cu eficienta
dovedita.
Art. 17
Imunofluorescenta - IF
a) Pentru fiecare izolat viral care trebuie sa fie identificat este necesar
sa se cultive cel putin 8 lamele sau echivalentul, cu celule la o densitate
care sa asigure o confluenta de aproximativ 60 - 90% dupa 24 ore de la
cultivare. Linia celulara EPC este recomandata pentru acest scop datorita
aderentei sale puternice la suprafetele de sticla, dar pot fi folosite, de
asemenea, si alte linii celulare cum sunt BF2, RTG2 sau FHM.
b) Virusul care trebuie sa fie identificat se inoculeaza cand celulele s-au
prins pe suprafata de sticla, la aproximativ o ora dupa tripsinizare, sau cand
culturile au fost incubate pana la 24 ore. Patru culturi sunt inoculate la un
raport volum la volum de 1:10 si patru culturi la un raport de 1:1.000. Acestea
sunt apoi incubate la 15 grade C pentru 20 - 30 de ore.
c) Dupa incubatie, culturile sunt clatite de doua ori in mediu Eagle's MEM
fara ser fetal, se fixeaza in 80% acetona rece si se coloreaza apoi prin
tehnica de imunofluorescenta indirecta - IFAT. Primul strat de reagent este
reprezentat de anticorpi monoclonali sau policlonali la o calitate de
referinta. Al doilea strat de reagent este reprezentat de un antiser -
antiimunoglobulinele utilizate in primul strat -, conjugat cu fluorocrom.
Pentru fiecare dintre antiserurile testate se utilizeaza cel putin o cultura
inoculata cu doza crescuta si o cultura inoculata cu doza scazuta. Este
necesara includerea in test a martorilor pozitivi si negativi. Este recomandata
folosirea fluorocromilor fluorescein izotiocianat - FITC - sau
tetrametil-rodamin-izotiocianat - TRITC.
d) Lamelele cu culturi celulare tratate cu reagentii de mai sus se monteaza
in glicerol salin. Se examineaza la microscop cu sursa de lumina ultravioleta -
UV. Se utilizeaza oculare de 10 x sau 12 x si obiective de x 25 sau x 40 cu
apertura mai mare de 0,7 si, respectiv, de 1,3.
e) Tehnica de IF descrisa mai sus este un exemplu. Pot fi aplicate si alte
tehnici de IF a caror eficacitate a fost dovedita: culturi celulare, fixare si
anticorpi de referinta.
Art. 18
ELISA
a) Godeurile din placa de microtitrare sunt captusite peste noapte cu
dilutii stabilite de fractiuni de imunoglobuline purificate provenite din
seruri de referinta.
b) Dupa spalarea godeurilor cu tampon fosfat salin - PBS-Tween 20, virusul
care trebuie identificat este pipetat in godeuri in trepte de dilutie din 2 in
2 sau din 4 in 4 si se lasa sa reactioneze cu anticorpii ce captusesc placa,
timp de 60 de minute la 37 grade C. Dupa spalare cu tampon PBS-Tween 20, sunt
adaugati anticorpii a caror specificitate corespunde cu cea a anticorpilor ce
captusesc godeurile si se lasa sa reactioneze 60 de minute la 20 grade C. Dupa
o alta spalare ca mai sus se adauga streptavidin conjugat cu peroxidaza din
hrean - HRP - si se lasa sa reactioneze pentru o ora la 20 grade C. Dupa ultima
spalare, enzima legata este vizualizata folosindu-se un substrat ELISA
corespunzator.
c) Reactia ELISA de mai sus cu biotina-avidina este un exemplu. Pot fi
folosite si alte tipuri de ELISA cu eficienta dovedita.
PARTEA a II-a
Procedurile de diagnostic pentru confirmarea SHV si NHI in episoadele de
boala
Art. 19
Una sau mai multe dintre urmatoarele tehnici trebuie sa fie efectuate
pentru diagnosticul SHV si NHI:
A. izolare virala cu identificare serologica ulterioara;
B. izolare virala cu identificare serologica simultana;
C. alte tehnici de diagnostic (IFAT, ELISA).
Art. 20
Confirmarea pentru prima data a SHV sau NHI in ferme din zone agreate nu
trebuie efectuata numai prin metoda C. Trebuie folosita, de asemenea, ori
metoda A ori B.
Art. 21
Probele de organe destinate examenului virusologic trebuie sa fie insotite
in anumite cazuri de material suplimentar in vederea efectuarii examenelor
bacteriologic, parazitologic, histologic sau a altor examene necesare
diagnosticului diferential.
A. Izolare virala cu identificare serologica ulterioara
1. a) Selectia probelor: cel putin 10 pesti ce prezinta semne tipice de NHI
sau SHV trebuie sa fie selectati pentru examinare.
b) Pregatirea si expedierea probelor de peste: astfel cum este prevazut in
partea I cap. I art. 5.
c) Colectarea de material suplimentar pentru diagnostic: astfel cum este
prevazut in partea I cap. I art. 6.
2. Prepararea probelor in vederea examinarii virusologice: astfel cum este
prevazut in partea I cap. II.
3. Examinarea virusologica: astfel cum este prevazut in partea I cap. III.
4. Identificarea virusului: astfel cum este prevazut in partea I cap. IV.
B. Izolare virala cu identificare serologica simultana
1. a) Selectia probelor: asa cum este prevazut la lit. A pct. 1 lit. a).
b) Pregatirea si expedierea probelor de peste: astfel cum este prevazut in
partea I cap. I art. 5.
c) Colectarea de material suplimentar pentru diagnostic: astfel cum este
prevazut in partea I cap. I art. 6.
2. a) Omogenizarea organelor: astfel cum este prevazut in partea I cap. II
art. 8.
b) Centrifugarea omogenatului: omogenatul este centrifugat intr-o
centrifuga cu racire la 2 - 5 grade C, la 2.000 - 4.000 x g, timp de 15 minute,
iar supernatantul este colectat si tratat pentru 4 ore la 15 grade C cu
antibiotice, de exemplu gentamicina 1mg/ml, sau filtrat prin membrana de 0,45
micrometri, cu procent scazut de legare a proteinei.
c) Tratarea supernatantului cu antiser: suspensia de organe tratata cu
antibiotice sau filtrata este diluata 1:10 si 1:1000 in mediu de culturi
celulare, iar parti din acesta se amesteca si se incubeaza 60 de minute la 15
grade C cu parti egale din reagentii mentionati in partea I cap. IV art. 16.
3. a) Culturile celulare si mediile de cultura: astfel cum sunt prevazute
in partea I cap. III art. 10;
b) Inocularea culturilor de celule: cel putin doua linii celulare sunt
inoculate cu 50 microlitri din fiecare amestec virus - ser (preparat astfel cum
este prevazut la pct. 2 de mai sus).
c) Incubarea culturilor celulare: astfel cum este prevazuta in partea I
cap. III art. 12.
d) Microscopie
- culturile celulare inoculate sunt controlate zilnic la microscop, pentru
verificarea aparitiei efectului citopatic, la o marire de la 40 x la 150 x.
Daca efectul citopatic este impiedicat sa apara de unul din antiserurile
folosite, virusul poate fi considerat a fi identificat corespunzator;
- daca nici unul dintre antiserurile folosite nu impiedica aparitia
efectului citopatic, se procedeaza la identificarea virusului in conformitate
cu cele prezentate in partea I cap. IV.
e) Subcultivarea: daca nu se produce nici un efect citopatic in 7 - 10
zile, se procedeaza la o subcultivare plecand de la culturi inoculate cu lichid
supernatant si mediu in conformitate cu lit. B pct. 2 c) si partea I cap. III
art. 14.
C. Alte tehnici de diagnostic
1. Lichidul supernatant preparat astfel cum este indicat in partea I cap.
II art. 9 poate fi supus unor tehnici de IFAT sau ELISA, in conformitate cu
partea I cap. IV art. 17 - 18.
2. Aceste tehnici rapide trebuie sa fie completate printr-un examen
virusologic in 48 de ore dupa prelevare, in conformitate cu lit. A sau B, daca:
a) a fost obtinut un rezultat negativ;
sau
b) a fost obtinut un rezultat negativ de la o prelevare reprezentand primul
caz de NHI sau SHV intr-o zona agreata.
3. Materialul tisular poate fi supus si altor tehnici de diagnostic cum ar
fi RT - PCR, IF pe sectiuni congelate sau imunohistochimie pe material tisular
fixat in formol.
4. Aceste tehnici trebuie sa fie intotdeauna insotite de inoculare pe
culturi celulare de material tisular nefixat.
PARTEA a III-a
Demonstrarea absentei anterioare de SHV si/sau NHI in zone sau ferme din
zone neagreate
Art. 22
Linii directoare si criterii care se aplica unui program de inspectii
sanitare veterinare oficiale
(1) Un program de inspectii sanitare veterinare poate fi pus in aplicare
doar in urmatoarele situatii:
a) dupa un program de eradicare a SHV si/sau NHI recunoscut oficial, care
sa cuprinda eliminarea tuturor pestilor din unitate, curatenie mecanica,
dezinfectie si lasarea pe uscat inainte de repopularea cu pesti din unitati
agreate;
sau
b) in unitati piscicole in care nu a evoluat anterior nici o infectie
legata de virusul SHV sau NHI.
(2) Programul de inspectii sanitare veterinare oficiale trebuie sa se
bazeze pe examinari clinice si examene de laborator.
(3) Programul trebuie sa cuprinda doua inspectii sanitare veterinare
clinice anuale, in conformitate cu cele indicate in partea I.
(4) Cel putin la una dintre inspectiile anuale, la fiecare dintre unitati
se preleveaza 30 de probe de tesut de peste si/sau lichid ovarian. Probele sunt
selectate, prelucrate si supuse unui examen de laborator in conformitate cu
cele prevazute in partea I cap. II si IV.
(5) Programul de inspectii sanitare veterinare trebuie sa fie aplicat
pentru cel putin 4 ani in toate unitatile din zona sau intr-o unitate dintr-o
zona neagreata, destinata sa fie agreata.
(6) Pentru ca un program sa fie recunoscut oficial, nu trebuie sa se
produca sau sa fie detectat nici un caz de SHV sau NHI, nici ca infectie
clinica, nici in urma unei izolari virale.
PARTEA a IV-a
Titrarea destinata verificarii sensibilitatii culturilor celulare la
infectie
Art. 23
Procedurile recomandate pentru titrarea la care se face referire in partea
I cap. III art. 12 sunt prezentate in continuare.
Art. 24
Este necesar sa se utilizeze cel putin doua tulpini de virus SHV si o
tulpina de virus NHI. Tulpinile trebuie sa fie reprezentative pentru
principalele tulpini virale din Uniunea Europeana, de exemplu, in ceea ce
priveste virusul SHV, o tulpina patogena provenind de la pastravul curcubeu din
apa dulce si o tulpina patogena din mediul marin pentru calcan, iar in ceea ce
priveste virusul NHI, o tulpina patogena pentru pastravul curcubeu provenind
din Europa. Este necesar sa se utilizeze tulpini virale bine definite provenind
din statele membre ale Uniunii Europene.
Art. 25
Tulpinile de referinta sunt disponibile in laboratoarele de referinta ale
Uniunii Europene pentru bolile pestilor.
Art. 26
Loturile de virus avand un numar redus de pasaje pe culturi celulare sunt
cultivate in flacoane de culturi celulare pe liniile BF2 sau RTG2 pentru
virusul SHV si pe linia celulara EPC pentru virusul NHI. Trebuie sa se
utilizeze un mediu de cultura la care sa se adauge cel putin 10% ser fetal.
Este necesar sa se utilizeze un indicator MOI, iar raportul dintre numarul de
particule virale infectioase ce se adauga la un numar cunoscut de celule
dintr-o cultura sa fie sub 1.
Art. 27
Atunci cand efectul citopatic este total, virusul din supernatant este
colectat prin centrifugarea culturilor celulare la 2000 x g pentru 15 minute,
sterilizat prin filtrare printr-un filtru de membrana de 0,45 micrometri si
distribuit in criotuburi notate. Virusul este pastrat la o temperatura de -80
grade C.
Art. 28
La o saptamana dupa inghetare 3 criotuburi cu cate o tulpina virala fiecare
sunt dezghetate in apa rece si titrate pe liniile celulare sensibile. Cel putin
la fiecare 6 luni, sau daca susceptibilitatea liniilor celulare se banuieste ca
a scazut, fiecare tulpina virala este dezghetata si titrata.
Art. 29
Procedura de titrare trebuie sa fie descrisa in detaliu pentru ca aceeasi
procedura sa fie urmata de fiecare data.
Art. 30
Titrarea prin dilutie limita trebuie sa cuprinda cel putin 6 replicari de
fiecare serie de dilutie. Titrurile sunt comparate cu titrurile obtinute
anterior. Daca titrul uneia dintre cele 3 tulpini virale scade cu un factor de
2 log sau mai mult, in raport cu titrul initial, linia celulara nu mai trebuie
sa fie utilizata in scop de supraveghere.
Art. 31
Daca liniile celulare sunt conservate in laborator, fiecare linie trebuie
sa fie examinata separat.
Art. 32
Registrele cu evidentele de laborator trebuie sa fie pastrate cel putin 10
ani.
PARTEA a V-a
Acronime si abrevieri
BF2 Bluegill fry (linie celulara)
ECP Efect citopatic
CRL Laborator de referinta al Comunitatii Europene pentru bolile
pestilor
ELISA Test imunoenzimatic
EPC Epithelioma papulosum cyprini (linie celulara)
FHM Fathead minnow (linie celulara)
FITC Fluorescein izotiocianat
Hepes Acid N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etan sulfonic
HRP Peroxidaza din hrean
IF Imunofluorescenta
IFAT Test de imunofluorescenta indirecta
NHI Necroza hematopoietica infectioasa
NPI Necroza pancreatica infectioasa
MEM Mediu minim esential
MOI Multiplicity of infection (raportul dintre numarul de particule
virale infectioase adaugate la un numar cunoscut de celule din
cultura)
OPD Ortho phenilen diamine
PBS Tampon fosfat salin
RTG2 Rainbow trout gonad (linie celulara)
RT-PCR Reversed transcriptase polymerase chain reaction
Tris-HCI Tris-hidroximetil-aminometan-HCI
TRITC Tetrametil-rodamin-izotiocianat
SHV Septicemia hemoragica virala
Art. 33
Anexele nr. 1, 2 si 3 fac parte integranta din prezenta norma sanitara
veterinara.
ANEXA 1
la norma sanitara veterinara
Tabelul 1 A
Schema de inspectie si recoltare pentru zonele si fermele din zonele
neagreate pentru o perioada de control de doi ani care preceda obtinerea
statutului de agreare pentru SHV si/sau NHI
______________________________________________________________________________
| | Numarul | Numarul | Examenele de laborator
|
| |inspectiilor|examinarilor| pentru prezenta de virus*1)|
| | clinice pe |de
laborator|____________________________|
| | an/doi ani | pe an/doi | Numarul de | Numarul de
|
| | | ani | pesti de
|reproducatori/|
| | | | diferite |fluid ovarian
|
| | | |marimi/organe|
|
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|Zone si ferme | | | |
|
|continentale: | | | |
|
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|a) Ferme | 2 | 2 |120 - prima |30 - prima
|
| cu reproducatori | | |inspectie*2) |inspectie*3)
|
| | | |150 - a doua |0 - a doua
|
| | | |inspectie |inspectie*3)
|
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|b) Ferme doar | 2 | 1 | 0 |150 - prima
|
| cu reproducatori | | | |sau a doua
|
| | | | |inspectie*3)
|
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|c) Ferme fara | 2 | 2 |150 - prima | 0
|
| reproducatori | | |si a doua |
|
| | | |inspectie |
|
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|Zone si ferme costiere:| | | |
|
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|a) Ferme | 2 | 2 |120 - prima |30 - prima
|
| cu reproducatori | | |inspectie |inspectie*3)
|
| | | |150 - a doua |0 - a doua
|
| | | |inspectie |inspectie*3)
|
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|b) Ferme de salmonide | 2 | 2 |30 - prima | 0
|
| fara reproducatori | | |si a doua |
|
| | | |inspectie*4) |
|
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|c) Ferme cu specii de | 2 | 2 |150 - prima | 0
|
| pesti, altele decat | | |si a doua |
|
| salmonide, fara | | |inspectie |
|
| reproducatori | | | |
|
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
Numar maxim de pesti/pool: 10.
------------
*1) O proba cu numar redus de pesti, conform tabelului 1B, se poate recolta
daca sunt indeplinite prevederile descrise in textul partii a II-a si a III-a
din prezenta norma sanitara veterinara.
*2) Inspectii clinice.
*3) In circumstante exceptionale, daca este imposibil sa se obtina lichid
ovarian, se vor recolta organe.
*4) Probele nu trebuie sa fie colectate mai devreme de 3 saptamani dupa
transferul pestilor din apa dulce in apa marina.
ANEXA 2
la norma sanitara veterinara
Tabelul 1 B
Schema de inspectie si recoltare pentru o perioada de control de doi ani care
preceda obtinerea statutului de agreare pentru SHV si/sau NHI in zone si ferme
din zone neagreate, pentru care absenta anterioara a bolilor a fost oficial
dovedita
______________________________________________________________________________
| | Numarul | Numarul | Examenele de laborator
|
| |inspectiilor|examinarilor| pentru prezenta de virus
|
| | clinice pe |de
laborator|____________________________|
| | an/doi ani | pe an/doi | Numarul de | Numarul de
|
| | | ani | pesti de
|reproducatori/|
| | | | diferite |fluid ovarian
|
| | | |marimi/organe|
|
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|Zone si ferme | | | |
|
|continentale: | | | |
|
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|a) Ferme | 2 | 2 |0 - prima |30 - prima
|
| cu reproducatori | | |inspectie*1) |inspectie*2)
|
| | | |30 - a doua |0 - a doua
|
| | | |inspectie |inspectie
|
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|b) Ferme doar | 2 | 1 | 0 |30 - prima
|
| cu reproducatori | | | |sau a doua
|
| | | | |inspectie*2)
|
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|c) Ferme fara | 2 | 2 |30 - prima | 0
|
| reproducatori | | |si a doua |
|
| | | |inspectie |
|
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|Zone si ferme costiere:| | | |
|
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|a) Ferme | 2 | 2 |0 - prima |30 - prima
|
| cu reproducatori | | |inspectie |inspectie*2)
|
| | | |30 - a doua |0 - a doua
|
| | | |inspectie |inspectie
|
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|b) Ferme de salmonide | 2 | 2 |30 - prima | 0
|
| fara reproducatori | | |si a doua |
|
| | | |inspectie*3) |
|
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
|c) Ferme cu specii de | 2 | 2 |30 - prima | 0
|
| pesti, altele decat | | |si a doua |
|
| salmonide, fara | | |inspectie |
|
| reproducatori | | | |
|
|_______________________|____________|____________|_____________|______________|
Numar maxim de pesti/pool: 10.
------------
*1) Inspectii clinice.
*2) In situatii exceptionale, daca este imposibil sa se obtina lichid
ovarian, se pot recolta organe.
*3) Probele nu trebuie sa fie recoltate mai devreme de 3 saptamani dupa
transferul pestilor din apa dulce in apa marina.
ANEXA 3
la norma sanitara veterinara
Tabelul 1 C
Schema de inspectie si recoltare pentru zonele si fermele din zone neagreate in
scopul mentinerii statutului de agreare pentru SHV si/sau NHI
______________________________________________________________________________
| | Numarul | Numarul de pesti in grupa de
|
| |inspectiilor| esantionare pentru examinare
|
| | clinice pe | de laborator*1)
|
| | an/doi ani
|__________________________________|
| | |Numarul de pesti| Numarul de
|
| | | de diferite | reproducatori/
|
| | | marimi/organe | fluid ovarian
|
|______________________________|____________|________________|_________________|
|Zone si ferme continentale: | | |
|
|______________________________|____________|________________|_________________|
|a) Ferme cu reproducatori | 2 |20 - prima sau a|10 - prima sau a
|
| | |doua inspectie |doua
inspectie*2)|
|______________________________|____________|________________|_________________|
|b) Ferme doar cu reproducatori| 2 | 0 |30 - prima sau a
|
| | | |doua
inspectie*2)|
|______________________________|____________|________________|_________________|
|c) Ferme fara reproducatori | 2 | 30 | 0
|
|______________________________|____________|________________|_________________|
|Zone si ferme costiere: | | |
|
|______________________________|____________|________________|_________________|
|a) Ferme cu reproducatori | 2 |20 - prima sau a|10 - prima sau a
|
| | |doua inspectie |doua
inspectie*2)|
|______________________________|____________|________________|_________________|
|b) Ferme fara reproducatori | 1 | 30*3) | 0
|
|______________________________|____________|________________|_________________|
Numar maxim de pesti/pool: 10.
------------
*1) In zonele agreate probele trebuie sa fie recoltate doar prin rotatie la
50% din ferme in fiecare an. In fermele agreate din zonele neagreate trebuie sa
fie recoltate in fiecare an.
*2) In situatii exceptionale, daca este imposibil sa se obtina lichid
ovarian, se pot recolta organe.
*3) Probele nu trebuie sa fie recoltate mai devreme de 3 saptamani dupa
transferul pestilor din apa dulce in apa marina.