ORDIN
Nr. 105 din 11 martie 2002
pentru aprobarea Normei sanitare veterinare cu privire la conditiile de
sanatate a animalelor si certificarea veterinara pentru importul din tari terte
de material seminal provenit de la bovine
ACT EMIS DE: MINISTERUL AGRICULTURII, ALIMENTATIEI SI PADURILOR
ACT PUBLICAT IN: MONITORUL OFICIAL NR. 556 din 30 iulie 2002
Ministrul agriculturii, alimentatiei si padurilor,
in temeiul prevederilor art. 31 alin. 1 din Legea sanitara veterinara nr.
60/1974, republicata, cu modificarile si completarile ulterioare,
in baza Hotararii Guvernului nr. 12/2001 privind organizarea si
functionarea Ministerului Agriculturii, Alimentatiei si Padurilor, cu
modificarile si completarile ulterioare,
vazand Referatul de aprobare nr. 153.704 din 25 februarie 2002, intocmit de
Agentia Nationala Sanitara Veterinara,
emite urmatorul ordin:
Art. 1
Se aproba Norma sanitara veterinara cu privire la conditiile de sanatate a
animalelor si certificarea veterinara pentru importul din tari terte de
material seminal provenit de la bovine, prevazuta in anexa care face parte
integranta din prezentul ordin.
Art. 2
Directiile sanitare veterinare judetene si a municipiului Bucuresti vor
aduce la indeplinire prevederile prezentului ordin.
Art. 3
Agentia Nationala Sanitara Veterinara va controla modul de aducere la
indeplinire a prevederilor prezentului ordin.
Art. 4
Prezentul ordin va fi publicat in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I,
si va intra in vigoare in termen de 15 zile de la data publicarii lui.
Ministrul agriculturii, alimentatiei si padurilor,
Ilie Sarbu
ANEXA 1
NORMA SANITARA VETERINARA
cu privire la conditiile de sanatate a animalelor si certificarea veterinara
pentru importul din tari terte de material seminal provenit de la bovine
Art. 1
Autoritatea sanitara veterinara centrala a Romaniei avizeaza importul de
material seminal provenit de la bovinele care indeplinesc conditiile stabilite
in certificatele de sanatate a animalelor prevazute in anexele nr. 1 - 4.
Art. 2
Tarile terte autorizate sa utilizeze modelul de certificat de sanatate a
animalelor prevazut in anexa nr. 1 sunt: Republica Ceha, Ungaria, Noua
Zeelanda, Polonia, Romania, Elvetia si Republica Slovaca.
Art. 3
Tara autorizata sa utilizeze modelul de certificat de sanatate a animalelor
prevazut in anexa nr. 2 este Statele Unite ale Americii.
Art. 4
Tara autorizata sa utilizeze modelul de certificat de sanatate a animalelor
prevazut in anexa nr. 3 este Canada, excluzand regiunea vaii Okanagan din
Columbia Britanica, care este definita ca zona delimitata de o linie trasata de
la un punct aflat pe granita care separa Canada de Statele Unite ale Americii,
de 120 grade 15' longitudine, 49 grade latitudine indreptata spre nord, catre
un punct de 119 grade 35' longitudine, 50 grade 30' latitudine, intr-o directie
nord-est catre un punct de 119 grade longitudine, 50 grade 45' latitudine,
intr-o directie sudica spre un punct aflat pe granita care separa Canada de
Statele Unite ale Americii, de 118 grade 15' longitudine si 49 grade
latitudine.
Art. 3
Tara autorizata sa utilizeze modelul de certificat de sanatate a animalelor
prevazut in anexa nr. 4 este Australia.
Art. 4
Testarea bovinelor pentru febra catarala si pentru boala hemoragica
epizootica se va efectua conform protocoalelor prevazute in anexa nr. 5.
Art. 5
Anexele nr. 1 - 5 fac parte integranta din prezenta norma sanitara
veterinara.
ANEXA 1
la norma sanitara veterinara
CERTIFICAT DE SANATATE A ANIMALELOR
pentru importul de material seminal provenit de la bovine
______________________________________________________________________________
| 1. Expeditor (numele si adresa completa)| Numarul certificatului
|
|__________________________________________|___________________________________|
| | 2. Tara terta a colectarii
|
|
|___________________________________|
| 3. Destinatar (numele si adresa | 4. Autoritatea sanitara
veterinara|
| completa) | competenta
|
|__________________________________________|___________________________________|
| | 5. Autoritatea sanitara
veterinara|
| | competenta locala
|
|__________________________________________|___________________________________|
| 6. Locul incarcarii | 7. Numele si adresa centrului de
|
| | colectare a materialului seminal
|
|__________________________________________|___________________________________|
| 8. Mijlocul de transport | 11. Numarul de autorizare a
|
|__________________________________________| centrului de colectare a
|
| 9. Locul si tara de destinatie | materialului seminal
|
|__________________________________________|
|
| 10. Numarul sigiliului containerelor cu |
|
| material seminal |
|
|__________________________________________|___________________________________|
| 12. Identificarea materialului seminal |
|
| proaspat sau congelat*) |
|
|__________________________________________|___________________________________|
| a) Numarul de doze | | c) Rasa
|
|_____________________________| b) Data (datele) colectarii
|________________|
| d) Identificarea animalului | |
|
| donator | |
|
|_____________________________|_______________________________|________________|
*) A se anula, dupa caz.
13. Subsemnatul .................., medic veterinar oficial, am citit si
imi este cunoscuta Directiva Consiliului 88/407/CEE si certific ca:
a) ........................................................................
(denumirea tarii exportatoare)
a fost indemna de pesta bovina si febra aftoasa pe o perioada de 12 luni
inainte de colectarea materialului seminal pentru export si pana la data de
expediere a sa, in cursul aceleiasi perioade nu s-a efectuat nici o vaccinare
impotriva acestor boli;
b) centrul de colectare a materialului seminal in care a fost colectat
materialul seminal ce urmeaza sa fie exportat a fost:
(i) autorizat conform conditiilor stabilite in cap. I din anexa A la
Directiva Consiliului 88/407/CEE;
(ii) condus si supravegheat conform conditiilor stabilite in cap. II din
anexa A la Directiva Consiliului 88/407/CEE;
(iii) indemn de rabie, tuberculoza, bruceloza, antrax si pleuropneumonia
contagioasa bovina pe o perioada de 30 de zile inainte de data colectarii
materialului seminal ce trebuie exportat si de 30 de zile dupa data colectarii
(in cazul materialului seminal proaspat pana in ziua expedierii);
c) bovinele care se gasesc la centrul de colectare a materialului seminal:
(i) provin din efective si/sau au fost fatate de mame care indeplinesc
conditiile prevazute la cap. I din anexa B la Directiva 88/407/CEE;
(ii) au fost supuse, inainte de a intra in izolare, testelor solicitate
conform cap. I din anexa B la Directiva 88/407/CEE;
(iii) au respectat cerintele de izolare inainte de intrare si pe cele de
testare stabilite conform cap. I din anexa B la Directiva 88/407/CEE;
(iv) au fost tinute cel putin un an si au fost supuse testelor de rutina
conform cap. II din anexa B la Directiva 88/407/CEE;
(d) materialul seminal ce trebuie exportat:
(i) a fost obtinut de la donatori care au fost tinuti in
...............................................................................
(denumirea tarii exportatoare)
o perioada de 6 luni inainte de colectarea materialului seminal pentru export
si care satisfac conditiile stabilite in anexa C la Directiva 88/407/CEE;
(ii) a fost obtinut de la donatori care:
1. se gasesc intr-un centru de colectare a materialului seminal in care
toate bovinele, in cursul a 12 luni inainte de colectarea materialului seminal
pentru export, au fost supuse, cu rezultate negative, unui test de
seroneutralizare sau unui test Elisa pentru rinotraheita infectioasa
bovina/vulvovaginita pustuloasa infectioasa*1); sau
2. au reactionat negativ la un test de seroneutralizare sau la un test
Elisa pentru rinotraheita infectioasa bovina/vulvovaginita pustuloasa
infectioasa, efectuat intr-o perioada de 12 luni inainte de colectarea
materialului seminal pentru export; sau
3. sunt seropozitivi, fiind vaccinati in concordanta cu cap. II din anexa B
la Directiva Consiliului 88/407/CEE si avand un rezultat negativ la un test de
seroneutralizare sau la un test Elisa, efectuat inainte de vaccinare in centrul
de colectare a materialului seminal aprobat;
(iii) a fost prelucrat, depozitat si transportat in conditii care
indeplinesc prevederile Directivei 88/407/CEE.
Intocmit la ..............................., la ...........................
(locul) (data)
___________
/ \ Semnatura*2) ......................................
| Stampila*2) | Numele si prenumele (cu majuscule) ................
\ ___________ / Titlul oficial ....................................
------------
*1) Se anuleaza, dupa caz.
*2) Semnatura si stampila trebuie sa fie de o culoare diferita de cea a
tipariturii.
ANEXA 2
la norma sanitara veterinara
CERTIFICAT DE SANATATE A ANIMALELOR
pentru importul de material seminal provenit de la bovine din Statele Unite ale
Americii
______________________________________________________________________________
| 1. Expeditor (numele si adresa completa)| Numarul certificatului
|
|
|___________________________________|
| | 2. Tara terta a colectarii
|
|__________________________________________|___________________________________|
| 3. Destinatar (numele si adresa | 4. Autoritatea sanitara
veterinara|
| completa) | competenta |
|__________________________________________|___________________________________|
| | 5. Autoritatea sanitara
veterinara|
| | competenta locala
|
|__________________________________________|___________________________________|
| 6. Locul incarcarii | 7. Numele si adresa centrului de
|
| | colectare a materialului seminal
|
|__________________________________________|___________________________________|
| 8. Mijlocul de transport |
|
|__________________________________________|
|
| 9. Locul si tara de destinatie | 11. Numarul de autorizare a
|
|__________________________________________| centrului de colectare a
|
| 10. Numarul sigiliului containerelor cu | materialului seminal
|
| material seminal |
|
|__________________________________________|___________________________________|
| 12. Identificarea materialului seminal |
|
| proaspat sau congelat*) | |
|__________________________________________|___________________________________|
| a) Numarul de doze | b) Data (datele) colectarii | c) Rasa
|
|_____________________________| |________________|
| d) Identificarea animalului | |
|
| donator | |
|
|_____________________________|_______________________________|________________|
*) A se anula, dupa caz.
13. Subsemnatul ......................, medic veterinar oficial, am citit
si imi sunt cunoscute prevederile Ordinului ministrului agriculturii,
alimentatiei si padurilor nr. 353/2001, publicat in Monitorul Oficial al
Romaniei, Partea I, nr. 111 din 11 februarie 2002, si certific ca:
a) ........................................................................
(denumirea tarii exportatoare)
a fost indemna de pesta bovina si febra aftoasa intr-o perioada de 12 luni
imediat inainte de colectarea materialului seminal pentru export si pana la
data de expediere a sa si in cursul aceleiasi perioade nu s-a efectuat nici o
vaccinare impotriva acestor boli;
b) centrul de colectare a materialului seminal in care a fost colectat
materialul seminal ce urmeaza sa fie exportat a fost:
(i) autorizat conform prevederilor Ordinului ministrului agriculturii,
alimentatiei si padurilor nr. 353/2001;
(ii) condus si supravegheat conform prevederilor Ordinului ministrului
agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 353/2001;
(iii) indemn de rabie, tuberculoza, bruceloza, antrax si pleuropneumonia
contagioasa bovina pe o perioada de 30 de zile inainte de data colectarii
materialului seminal ce trebuie exportat si de 30 de zile dupa colectare (in
cazul materialului seminal proaspat pana in ziua expedierii);
c) bovinele care se gasesc la centrul de colectare a materialului seminal:
(i) provin din efective si/sau au fost fatate de mame care indeplinesc conditiile
prevazute de Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si padurilor nr.
353/2001;
(ii) au fost supuse, inainte de a intra in izolare, testelor prevazute in
Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 353/2001;
(iii) au respectat cerintele de izolare inainte de intrare si pe cele de
testare stabilite in Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si
padurilor nr. 353/2001;
(iv) au fost tinute cel putin un an si au fost supuse testelor de rutina
conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si padurilor nr.
353/2001;
d) materialul seminal ce trebuie exportat:
(i) a fost obtinut de la donatori care au fost tinuti in
...............................................................................
(denumirea tarii exportatoare)
o perioada de 6 luni imediat inainte de colectarea materialului seminal pentru
export, si care indeplinesc conditiile prevazute in Ordinul ministrului
agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 353/2001;
(ii) a fost obtinut de la donatori care:
1. se gasesc intr-un centru de colectare a materialului seminal in care
toate bovinele, in cursul a 12 luni inainte de colectarea materialului seminal
pentru export, au fost supuse, cu rezultate negative, unui test de
seroneutralizare sau unui test Elisa pentru rinotraheita infectioasa
bovina/vulvovaginita pustuloasa infectioasa*1); sau
2. reactioneaza negativ la un test de seroneutralizare sau un test Elisa
pentru rinotraheita infectioasa bovina/vulvovaginita pustuloasa infectioasa,
efectuat intr-o perioada de 12 luni inainte de colectarea materialului seminal
pentru export; sau
3. sunt seropozitivi, fiind vaccinati conform Ordinului ministrului
agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 353/2001 si avand un rezultat
negativ la un test de seroneutralizare sau la un test Elisa, efectuat inainte
de vaccinare in centrul de colectare a materialului seminal aprobat;
(iii) a fost prelucrat, depozitat si transportat conform Ordinului
ministrului agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 353/2001;
(iv) a fost obtinut de la tauri donatori care au fost supusi de doua ori,
la interval de cel mult 12 luni, inainte si dupa colectare, la urmatoarele
teste, cu rezultate negative, intr-un laborator autorizat (testarea dupa
colectare trebuie sa fie efectuata pe o proba de sange prelevata cu nu mai
putin de 21 de zile dupa colectarea materialului seminal pentru export):
1. un test Elisa competitiv pentru febra catarala, conform anexei nr. 5 la
prezenta norma sanitara veterinara;
2. un test de imunodifuzie in gel de agar conform anexei nr. 5 la prezenta
norma sanitara veterinara si un test de neutralizare pentru toate serotipurile
virusului bolii hemoragice epizootice cunoscute ca existand in tara exportatoare.
Intocmit la ..............................., la ...........................
(locul) (data)
___________
/ \ Semnatura*2) ......................................
| Stampila*2) | Numele si prenumele (cu majuscule) ................
\ ___________ / Titlul oficial ....................................
------------
*1) Se anuleaza, dupa caz.
*2) Semnatura si stampila trebuie sa fie de o culoare diferita de cea a
tipariturii.
ANEXA 3
la norma sanitara veterinara
CERTIFICAT DE SANATATE A ANIMALELOR
pentru importul de material seminal provenit de la bovine
______________________________________________________________________________
| 1. Expeditor (numele si adresa completa)| Numarul certificatului
|
|
|___________________________________|
| | 2. Tara terta a colectarii
|
|__________________________________________|___________________________________|
| 3. Destinatar (numele si adresa | 4. Autoritatea sanitara
veterinara|
| completa) | competenta |
|__________________________________________|___________________________________|
| | 5. Autoritatea sanitara
veterinara|
| | competenta locala |
|__________________________________________|___________________________________|
| 6. Locul incarcarii | 7. Numele si adresa centrului de
|
| | colectare a materialului seminal
|
|__________________________________________|___________________________________|
| 8. Mijlocul de transport |
|
|__________________________________________|
|
| 9. Locul si statul membru de destinatie | 11. Numarul de autorizare a
|
|__________________________________________| centrului de colectare a
|
| 10. Numarul sigiliului containerelor cu | materialului seminal
|
| material seminal |
|
|__________________________________________|___________________________________|
| 12. Identificarea materialului seminal |
|
| proaspat sau congelat*) | |
|__________________________________________|___________________________________|
| a) Numarul de doze | b) Data (datele) colectarii | c) Rasa
|
|_____________________________| |________________|
| d) Identificarea animalului | |
|
| donator | |
|
|_____________________________|_______________________________|________________|
*) A se anula, dupa caz.
13. Subsemnatul ......................, medic veterinar oficial, am citit
si imi sunt cunoscute prevederile Ordinului ministrului agriculturii,
alimentatiei si padurilor nr. 353/2001, publicat in Monitorul Oficial al
Romaniei, Partea I, nr. 111 din 11 februarie 2002, si certific ca:
a) ........................................................................
(denumirea tarii exportatoare)
a fost indemna de pesta bovina si febra aftoasa intr-o perioada de 12 luni
imediat inainte de colectarea materialului seminal pentru export si pana la
data de expediere a sa si in cursul aceleiasi perioade nu s-a efectuat nici o
vaccinare impotriva acestor boli;
b) centrul de colectare a materialului seminal in care a fost colectat
materialul seminal ce urmeaza sa fie exportat a fost:
(i) autorizat conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si
padurilor nr. 353/2001;
(ii) condus si supravegheat conform Ordinului ministrului agriculturii,
alimentatiei si padurilor nr. 353/2001;
(iii) indemn de rabie, tuberculoza, bruceloza, antrax si pleuropneumonia
contagioasa bovina o perioada de 30 de zile inainte de data de colectare a
materialului seminal ce trebuie exportat si de 30 de zile dupa colectare (in
cazul materialului seminal proaspat pana in ziua expedierii);
c) bovinele care se gasesc la centrul de colectare a materialului seminal:
(i) provin din efective si/sau au fost fatate de mame care indeplinesc
conditiile prevazute in Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si
padurilor nr. 353/2001;
(ii) au fost supuse, inainte de a intra in izolare, testelor prevazute in
Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 353/2001;
(iii) au respectat cerintele de izolare inainte de intrare si pe cele de
testare prevazute in Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si
padurilor nr. 353/2001;
(iv) au fost tinute pentru cel putin un an, au fost supuse testelor de
rutina, conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si padurilor
nr. 353/2001 si cap. II din anexa B la Directiva 88/407/CEE;
d) materialul seminal ce trebuie exportat:
(i) a fost obtinut de la donatori care au fost tinuti in
...............................................................................
(denumirea tarii exportatoare)
o perioada de 6 luni imediat inainte de colectarea materialului seminal pentru
export si care indeplinesc conditiile prevazute in Ordinul ministrului
agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 353/2001;
(ii) a fost obtinut de la donatori care:
1. se gasesc intr-un centru de colectare a materialului seminal in care
toate bovinele, in cursul a 12 luni inainte de colectarea materialului seminal
pentru export, au fost supuse, cu rezultate negative, unui test de
seroneutralizare sau unui test Elisa pentru rinotraheita infectioasa
bovina/vulvovaginita pustuloasa infectioasa*1); sau
2. au reactionat negativ la un test de seroneutralizare sau la un test
Elisa pentru rinotraheita infectioasa bovina/vulvovaginita pustuloasa
infectioasa, efectuat intr-o perioada de 12 luni inainte de colectarea
materialului seminal pentru export; sau
3. sunt seropozitivi, fiind vaccinati conform Ordinului ministrului
agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 353/2001, avand un rezultat negativ
la un test de seroneutralizare sau la un test Elisa, efectuat inainte de
vaccinare, in centrul de colectare a materialului seminal aprobat;
(iii) a fost prelucrat, depozitat si transportat conform Ordinului
ministrului agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 353/2001;
(iv) a fost obtinut de la tauri donatori care, fie:
1. se gaseau in centrul autorizat de colectare a materialului seminal la
data de 1 iulie 1994; fie
2. au fost introdusi in centrul autorizat dupa data de 1 iulie 1994, fiind
supusi, cu rezultate negative, urmatoarelor teste pentru febra catarala si
boala hemoragica epizootica, intr-un laborator autorizat, inainte de a intra in
centru si in orice caz au fost supusi semestrial, cu rezultate negative,
urmatoarelor teste, intr-un laborator autorizat:
- test Elisa competitiv pentru febra catarala conform anexei nr. 5 la
prezenta norma sanitara veterinara;
- test de imunodifuzie in gel de agar, conform anexei nr. 5 la prezenta
norma sanitara veterinara si test de neutralizare pentru toate serotipurile
virusului bolii hemoragice epizootice gasite in tara exportatoare.
Intocmit la ..............................., la ...........................
(locul) (data)
___________
/ \ Semnatura*2) ......................................
| Stampila*2) | Numele si prenumele (cu majuscule) ................
\ ___________ / Titlul oficial ....................................
------------
*1) Se anuleaza, dupa caz.
*2) Semnatura si stampila trebuie sa fie de o culoare diferita de cea a
tipariturii.
ANEXA 4
la norma sanitara veterinara
CERTIFICAT DE SANATATE A ANIMALELOR
pentru importul de material seminal provenit de la bovine
______________________________________________________________________________
| 1. Expeditor (numele si adresa completa)| Numarul certificatului
|
|
|___________________________________|
| | 2. Tara terta a colectarii
|
|__________________________________________|___________________________________|
| 3. Destinatar (numele si adresa | 4. Autoritatea sanitara
veterinara|
| completa) | competenta
|
|__________________________________________|___________________________________|
| | 5. Autoritatea sanitara
veterinara|
| | competenta locala
|
|__________________________________________|___________________________________|
| 6. Locul incarcarii | 7. Numele si adresa centrului de
|
| | colectare a materialului seminal
|
|__________________________________________|___________________________________|
| 8. Mijlocul de transport | 11. Numarul de autorizare a
|
|__________________________________________| centrului de colectare a
|
| 9. Locul si statul membru de destinatie | materialului seminal
|
|__________________________________________| |
| 10. Numarul sigiliului containerelor cu |
|
| material seminal |
|
|__________________________________________|___________________________________|
| 12. Identificarea materialului seminal |
|
| proaspat sau congelat*) |
|
|__________________________________________|___________________________________|
| a) Numarul de doze | b) Data (datele) colectarii | c) Rasa
|
|_____________________________|
|________________|
| d) Identificarea animalului | |
|
| donator | |
|
|_____________________________|_______________________________|________________|
*) A se anula, dupa caz.
13. Subsemnatul, ...................., medic veterinar oficial, am citit si
imi sunt cunoscute prevederile Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei
si padurilor nr. 353/2001 si certific ca:
a) ........................................................................
(denumirea tarii exportatoare)
a fost indemna de pesta bovina si febra aftoasa intr-o perioada de 12 luni
imediat inainte de colectarea materialului seminal pentru export si pana la
data de expediere a sa si in cursul aceleiasi perioade nu s-a efectuat nici o
vaccinare impotriva acestor boli;
b) centrul de colectare a materialului seminal in care a fost colectat
materialul seminal ce urmeaza sa fie exportat a fost:
(i) autorizat conform prevederilor Ordinului ministrului agriculturii,
alimentatiei si padurilor nr. 353/2001;
(ii) condus si supravegheat conform prevederilor Ordinului ministrului
agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 353/2001;
(iii) indemn de rabie, tuberculoza, bruceloza, antrax si pleuropneumonia
contagioasa bovina o perioada de 30 de zile inainte de data colectarii
materialului seminal ce trebuie exportat si de 30 de zile dupa colectare (in
cazul materialului seminal proaspat pana in ziua expedierii);
c) bovinele care se gasesc la centrul de colectare a materialului seminal:
(i) provin din efective si/sau au fost fatate de mame care indeplinesc
conditiile prevazute in Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si
padurilor nr. 353/2001;
(ii) au fost supuse, inainte de a intra in izolare, testelor prevazute in
Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 353/2001;
(iii) au respectat cerintele de izolare inainte de intrare si pe cele de
testare, prevazute in Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si
padurilor nr. 353/2001;
(iv) au fost tinute cel putin un an si au fost supuse testelor de rutina,
conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentatiei si padurilor nr.
353/2001;
d) materialul seminal ce trebuie exportat:
(i) a fost obtinut de la donatori care au fost tinuti in
...............................................................................
(denumirea tarii exportatoare)
o perioada de 6 luni imediat inainte de colectarea materialului seminal pentru
export si care indeplinesc conditiile prevazute in Ordinul ministrului
agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 353/2001;
(ii) a fost obtinut de la donatori care:
1. se gasesc intr-un centru de colectare a materialului seminal in care
toate bovinele, in cursul a 12 luni inainte de colectarea materialului seminal
pentru export, au fost supuse, cu rezultate negative, unui test de
seroneutralizare sau unui test Elisa pentru rinotraheita infectioasa
bovina/vulvovaginita pustuloasa infectioasa*1); sau
2. au reactionat negativ la un test de seroneutralizare sau la un test
Elisa pentru rinotraheita infectioasa bovina/vulvovaginita pustuloasa
infectioasa, efectuat pe perioada a 12 luni inainte de colectarea materialului
seminal pentru export; sau
3. sunt seropozitivi, fiind vaccinati, conform Ordinului ministrului
agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 353/2001, avand rezultat negativ la
un test de seroneutralizare sau la un test Elisa, efectuat in centrul aprobat
de colectare a materialului seminal inainte de vaccinare;
(iii) a fost prelucrat, depozitat si transportat conform Ordinului
ministrului agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 353/2001;
(iv) a fost obtinut de la tauri donatori care au fost supusi de doua ori,
la interval de cel mult 12 luni, inainte si dupa colectare, la urmatoarele
teste, cu rezultate negative, intr-un laborator autorizat (testul in urma
colectarii trebuie sa fie efectuat pe o proba de sange prelevata cu nu mai
putin de 21 de zile dupa colectarea materialului seminal pentru export):
1. un test Elisa competitiv pentru febra catarala, conform anexei nr. 5 la
prezenta norma sanitara veterinara;
2. un test de imunodifuzie in gel de agar, conform anexei nr. 5 la prezenta
norma sanitara veterinara si un test de neutralizare pentru toate serotipurile
virusului bolii hemoragice epizootice cunoscute ca existand in tara
exportatoare.
3. un test seroneutralizare pentru virusul Akabane.
Intocmit la ..............................., la ...........................
(locul) (data)
___________
/ \ Semnatura*2) ......................................
| Stampila*2) | Numele si prenumele (cu majuscule) ................
\ ___________ / Titlul oficial ....................................
------------
*1) Se anuleaza, dupa caz.
*2) Semnatura si stampila trebuie sa fie de o culoare diferita de cea a
tipariturii.
ANEXA 5
la norma sanitara veterinara
PROTOCOL
pentru un test Elisa competitiv "test de imunoabsorbtie cu legatura
enzimatica", test utilizand anticorpi monoclonali specifici de grup pentru
detectarea anticorpilor virusului febrei catarale
Test competitiv Elisa pentru febra catarala, utilizand anticorpul
monoclonal 3-17-A3
Testul este capabil sa detecteze anticorpi fata de toate serotipurile
cunoscute ale virusului febrei catarale "VFC".
Principiul testului este intreruperea reactiei dintre antigenul VFC si un
anticorp monoclonal specific de grup "3-17-A3" prin adaugarea de
dilutii ale serului de testat. Anticorpii VFC prezenti in serul de testat
blocheaza reactivitatea anticorpului monoclonal "AcM" si rezulta o
atenuare a schimbarii asteptate a culorii in momentul adaugarii substratului enzimatic.
Materiale si reagenti
1. Placi de microtitrare cu fund plat
2. Antigen: preparat in modul descris mai jos
3. Tampon de blocare: lapte praf deshidratat "Marvel" 5%
"w/v", Tween-20 0,1% "v/v" "furnizat ca solutie de
polioxietilena sorbiton monolaurat" in solutie salina tamponata - fosfat
"PBS"
4. Anticorp monoclonal 3-17-A3 "furnizat ca supernatant de cultura
tisulara hibridoma" depozitat la temperatura de -20 grade C sau
liofilizat, diluat 1/50, cu tampon de blocare inainte de utilizare, dirijat
contra polipeptidei p7 specifica de grup
5. Conjugat: globulina de iepure antisoarece "absorbita si
eluata", conjugata cu peroxidaza de hrean si pastrata la intuneric la
temperatura de 4 grade C
6. Substrat si cromogen: 0,2 g de ortofenilen-diamina "OFD"
dizolvata intr-un tampon constand in 2,553 g acid citric si 4,574 g di-sodium
hidrogenortofosfat adus la 500 ml cu apa distilata, impartita in cote-parti de
25 ml si pastrata la intuneric la temperatura de -20 grade C, cu 12 micro l/25
ml de peroxid de hidrogen "30% w/v" adaugat imediat inainte de
utilizare
A se manipula OFD cu precautii - a se purta manusi din cauciuc - suspect de
a fi mutagen
7. Acid sulfuric 1 M: 26,6 ml de acid adaugat la 474,4 ml apa distilata
Atentie - Intotdeauna se adauga acid in apa, niciodata apa in acid
8. Agitator orbital
9. Cititor de placi Elisa - testul poate fi citit vizual
Protocol de testare
H G F E D C B A
__________________________________________________
Martor | | | Antigen + conjugat | | | 1
|_____|_____|__________________________|_____|_____|
Controlul AcM | | | | | | 2
| | | Antigen + AcM + conjugat | | |
Controlul pozitivelor |_____|_____|__________________________|_____|_____| 3
| Antigen + ser pozitiv + AcM + conjugat |
|__________________________________________________|
| 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/64 |1/128|1/256|
|_____|_____|_____|______|______|______|_____|_____|
| Seruri de testat |
|__________________________________________________|
| 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16| 4
|_____|_____|_____|______|______|______|_____|_____|
| | | | | | | | |
|_____|_____|_____|______|______|______|_____|_____| 5
| | | | | | | | |
Seruri de testat |_____|_____|_____|______|______|______|_____|_____| 6
| | | | | | | | |
|_____|_____|_____|______|______|______|_____|_____| 7
| | | | | | | | |
|_____|_____|_____|______|______|______|_____|_____| 8
| | | | | | | | |
|_____|_____|_____|______|______|______|_____|_____| 9
| | | | | | | | |
|_____|_____|_____|______|______|______|_____|_____| 10
| | | | | | | | |
|_____|_____|_____|______|______|______|_____|_____| 11
| | | | | | | | |
|_____|_____|_____|______|______|______|_____|_____| 12
Protocol de testare
Controlul martorului
Randul 1A - H reprezinta un control al martorului constand in antigen VFC
si conjugat. Acesta poate fi utilizat pentru a etalona cititorul Elisa.
Controlul AcM
Randul 2A - H reprezinta controlul anticorpului monoclonal si consta in
antigen VFC, anticorp monoclonal si conjugat. Acesta reprezinta un control
negativ. Media citirilor densitatilor optice pentru acest rand de control
reprezinta valoarea de inhibitie 0% .
Controlul pozitiv
Randul 3A - H reprezinta controlul pozitiv. Acesta consta in antigen VFC,
dilutii ale antiserului pozitiv VFC, AcM si conjugat. Acesta este inclus ca un
indicator al faptului ca testul functioneaza corespunzator si ca de la test la
test trebuie sa fie obtinute niveluri similare de inhibitie.
Seruri de testat
In schema de testare prezentata mai sus pot fi testate 18 seruri la o rata
a dilutiei de 1/2, 1/4, 1/8, 1/16. Aceasta va da unele indicatii asupra
titrului de anticorpi in serul de testat. Aceasta gama de dilutii poate fi
extinsa ulterior pentru a se obtine titruri finale ale dilutiei serului. In mod
alternativ, pentru studiile serologice la scara mare, serurile pot fi testate
la o dilutie unica de 1/4 sau la doua dilutii de 1/2 si 1/4 ca un test de control
rapid.
Procedura
1. Se dilueaza antigenul VFC cu concentratie pretitrata in PBS, se agita
pentru scurt timp folosindu-se baia de ultrasunete pentru a dispersa virusul
agregat, iar "daca baia de ultrasunete nu este disponibila, se pipeteaza
viguros" si se adauga 50 micro l in toate godeurile placii Elisa. Se
lovesc usor marginile placii pentru a dispersa antigenul.
2. Se incubeaza la temperatura de 37 grade C timp de 60 de minute intr-un
agitator orbital. Se spala placile de trei ori prin umplerea si golirea
godeurilor cu PBS nesteril si se usuca cu hartie absorbanta.
3. Se adauga 50 micro l de tampon de blocare pentru fiecare godeu. Se
adauga serurile de testat si serul pozitiv in godeurile corespunzatoare si se
dilueaza pe suprafata placii utilizandu-se o pipeta cu canale multiple. Nu se
adauga ser in cazul controlului cu blanc sau controlului AcM.
4. Imediat dupa adaugarea serurilor de testat se dilueaza AcM in tamponul
de blocare "cu dilutie pretitrata" si se adauga 50 ml in toate
godeurile placii, cu exceptia controlului cu blanc.
5. Se incubeaza la temperatura de 37 grade C timp de 60 de minute intr-un
agitator orbital. Se spala de trei ori cu PBS si se usuca.
6. Se dilueaza concentratul de globuline de iepure antisoarece la 1/5000 in
tampon de blocare si se adauga 50 micro l in toate godeurile placii.
7. Se incubeaza la temperatura de 37 grade C timp de 60 de minute intr-un
agitator orbital. Se spala de trei ori cu PBS si se usuca.
8. Se dezgheata OPD si imediat inainte de utilizare se adauga 12 micro l
din peroxid de hidrogen 30% la fiecare 25 ml de OPD. Se adauga 50 micro l in
toate godeurile placii. Se asteapta aproximativ 10 minute pentru a se modifica
culoarea si se opreste reactia cu acid sulfuric 1M "50 micro
l/godeu". Culoarea trebuie sa se modifice in godeurile de control al AcM
si in acele godeuri care contin seruri fara nici un anticorp VFC.
9. Se examineaza si se inregistreaza placile fie vizual, fie utilizandu-se
un cititor spectrofotometric.
Analiza rezultatelor
Se calculeaza media citirilor densitatilor optice "DO"
plecandu-se de la controalele AcM. Aceasta reprezinta valoarea de inhibitie 0%
. Citirile densitatii optice ale serurilor de testat sunt exprimate ca valori
procentuale de inhibitie, utilizandu-se urmatoarea formula:
Valoarea procentuala DO in prezenta serului de testat
de inhibitie = 100 - ---------------------------------- x 100
DO in absenta serului de testat
Valorile de inhibitie mai mari de 40% la o dilutie a serului de 1/4 sunt
considerate pozitive. Citirea vizuala este posibila daca o inhibitie de 40%
este cea mai mica valoare usor vizibila cu ochiul liber.
Prepararea antigenului VFC pentru tehnica Elisa
1. Se spala de 3 ori 10 placi de celule confluente BHK-21 cu mediul Eagle's
fara ser si se infecteaza cu serotipul 1 al virusului febrei catarale intr-un
mediu Eagle's fara ser.
2. Se incubeaza la temperatura de 37 grade C si se examineaza zilnic pentru
efectul citopatic "ecp".
3. Atunci cand ecp este evident pe 80 - 90% din stratul de celule al
fiecarei placi, se recupereaza virusul prin agitarea celulelor aderente de
sticla.
4. Se centrifugheaza la 2.000 - 3.000 rot./min. pentru a precipita
celulele.
5. Se inlatura supernatantul si se resuspenda celulele in aproximativ 30 ml
de PBS continand 1% "Sarkosyl" si 2 ml de fluorura de
fenilmetilsulfonil "tampon de liza".
Aceasta poate determina celulele sa formeze un gel si se pot adauga mai
multe tampoane de liza pentru a reduce acest efect.
NOTA:
Fluorura de fenilmetilsulfonil este daunatoare - a se manipula cu prudenta
extrema!
6. Se fragmenteaza celulele timp de 60 de secunde, folosindu-se o sonda
ultrasonica la o amplitudine de 30 de microni.
7. Se centrifugheaza la 10.000 rot./min. timp de 10 minute.
8. Se depoziteaza supernatantul la temperatura de +4 grade C si se
resuspenda celulele precipitate ramase in 10 - 20 ml de tampon de liza.
9. Se agita cu ajutorul unui aparat cu ultrasunete si se clarifica,
depozitand supernatantul in fiecare etapa, in total de 3 ori.
10. Se reunesc supernatantii si se centrifugheaza la 24.000 rot./min. timp
de 120 de minute la temperatura de 4 grade C pe un tampon de 5 ml de sucroza
40% "w/v in PBS", folosindu-se tuburi de centrifugare Beckmann de 30
ml si un rotor SW 28.
11. Se inlatura supernatantul, se dreneaza tuburile in intregime si se
resuspenda granula de reziduu celular in PBS prin supunerea la ultrasunete. Se
depoziteaza antigenul in cote-parti la -70 grade C.
Titrarea antigenului VFC pentru tehnica Elisa
Antigenul febrei catarale este titrat prin tehnica Elisa indirecta. Dilutii
in baza doi de antigen sunt titrate fata de o dilutie constanta
"1/50" de anticorpi monoclonali 3-17-A3. Protocolul este dupa cum
urmeaza:
Procedura
1. Se dilueaza antigen VFC in PBS de-a lungul placii de microtitrare in
serii de dilutii, in baza doi "50 micro l/godeu", utilizandu-se o
pipeta cu canale multiple.
2. Se incubeaza timp de o ora la temperatura de 37 grade C intr-un agitator
orbital.
3. Se spala placile de trei ori cu PBS.
4. Se adauga 50 micro l din anticorpul monoclonal 3 - 17 - A3 "diluat
1/50" in fiecare godeu al placii de microtitrare.
5. Se incubeaza timp de o ora la temperatura de 37 grade C intr-un agitator
orbital.
6. Se spala placile de trei ori cu PBS.
7. Se adauga in fiecare godeu al placii de microtitrare 50 micro l de
globulina de iepure antisoarece conjugata la peroxidaza de hrean, diluata pana
la o concentratie optima pretitrata.
8. Se incubeaza o ora la temperatura de 37 grade C intr-un agitator
orbital.
9. Se adauga substrat si cromogen dupa cum s-a descris anterior. Se opreste
reactia dupa 10 minute, prin adaugarea de acid sulfuric 1 M "50 micro
l/godeu".
In testul concurent anticorpul monoclonal trebuie sa fie in exces, de aceea
se alege o dilutie de antigen care cade pe curba de titrare "nu pe zona
platou", care da aproximativ 0,8 DO dupa 10 minute.
Protocolul pentru testul de imunodifuzie pe gel de agar pentru detectarea
anticorpilor bolii hemoragice epizootice
Testul de imunodifuzie pe gel de agar este efectuat in concordanta cu
urmatorul protocol:
Materiale si reactivi
1. Antigen
Antigenul care precipita este preparat in orice sistem de cultura celulara
care sustine multiplicarea rapida a serotipului "serotipurilor"
virale corespunzatoare ale virusului bolii hemoragice epizootice. Sunt
recomandate celulele BKH sau celulele Vero. Antigenul este prezent in fluidul
supernatant la finalul cresterii virusului, dar pentru a fi eficient necesita o
concentrare de la 50 pana la 100 de ori. Aceasta poate fi realizata prin orice
procedura standard de concentrare a proteinelor; virusul antigenului poate fi
inactivat prin adaugarea de betapropiolactona 0,3% "v/v".
2. Serul de control pozitiv cunoscut
Utilizandu-se serul international de referinta si antigenul, este produs un
ser standard national, standardizat pentru proportia optima fata de serul
international de referinta, liofilizat si utilizat ca ser de control cunoscut
in fiecare test.
3. Serul de testat
Procedura
1. Agaroza 1% preparata in tampon de borat sau de barbitol de sodiu, pH de
la 8,5 la 9,0, este turnata intr-o placa Petri de o adancime minima de 3,0 mm.
2. Un sablon de testat din 7 godeuri lipsite de umiditate, fiecare cu un
diametru de 5,0 mm, este taiat in agar. Sablonul consta intr-un godeu central
si 6 godeuri aranjate in jurul lui intr-un cerc cu o raza de 3 mm.
1
6 2
X
5 3
4
3. Godeul central este umplut cu antigenul standard. Godeurile periferice
2, 4 si 6 sunt umplute cu ser pozitiv cunoscut, iar godeurile 1, 3 si 5 sunt
umplute cu seruri de testat.
4. Sistemul este incubat o perioada de pana la 72 de ore la temperatura
camerei, intr-o camera umeda inchisa.
Interpretare
Un ser de testat este pozitiv daca formeaza o linie de precipitare
specifica cu antigenul si formeaza o linie completa de identitate cu serul de
control. Un ser de testat este negativ daca nu formeaza o linie specifica cu
antigenul si nu deviaza curba serului de control. Placile Petri trebuie sa fie
examinate pe fond intunecat si utilizandu se iluminare indirecta.