ORDIN   Nr. 967 din 25 noiembrie 2003

privind aprobarea Normei sanitare veterinare ce stabileste metode nationale de analiza pentru determinarea vitaminei A, a vitaminei E si a triptofanului din furaje

ACT EMIS DE: MINISTERUL AGRICULTURII, PADURILOR, APELOR SI MEDIULUI

ACT PUBLICAT IN: MONITORUL OFICIAL  NR. 7 din  7 ianuarie 2004

    In temeiul prevederilor art. 31 alin. (1) din Legea sanitara veterinara nr. 60/1974, republicata,
    in baza Hotararii Guvernului nr. 739/2003 privind organizarea si functionarea Ministerului Agriculturii, Padurilor, Apelor si Mediului,
    vazand Referatul de aprobare nr. 155.067 din 23 septembrie 2003, intocmit de Agentia Nationala Sanitara Veterinara,

    ministrul agriculturii, padurilor, apelor si mediului emite urmatorul ordin:

    Art. 1
    Se aproba Norma sanitara veterinara ce stabileste metode nationale de analiza pentru determinarea vitaminei A, a vitaminei E si a triptofanului din furaje, prevazuta in anexa care face parte integranta din prezentul ordin.
    Art. 2
    Institutele centrale de profil si directiile sanitare veterinare judetene si a municipiului Bucuresti vor duce la indeplinire prevederile prezentului ordin.
    Art. 3
    Agentia Nationala Sanitara Veterinara va controla modul de indeplinire a prezentului ordin.
    Art. 4
    Prezentul ordin se va publica in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I.

           Ministrul agriculturii, padurilor, apelor si mediului,
                                  Ilie Sarbu

    ANEXA 1

                          NORMA SANITARA VETERINARA
ce stabileste metode nationale de analiza pentru determinarea vitaminei A, a vitaminei E si a triptofanului din furaje

    Art. 1
    Autoritatea veterinara centrala a Romaniei trebuie sa solicite ca analizele efectuate in scopul controalelor oficiale pentru determinarea continutului de vitamina A, vitamina E si triptofan al furajelor si premixurilor sa fie efectuate folosindu-se metoda stabilita in anexa la prezenta norma sanitara veterinara.
    Art. 2
    (1) Autoritatea veterinara centrala a Romaniei trebuie sa implementeze, pana cel tarziu la 31 august 2005, actele normative, reglementarile sau prevederile administrative necesare pentru a se supune prevederilor prezentei norme sanitare veterinare.
    (2) Cand autoritatea veterinara centrala a Romaniei adopta aceste masuri, acestea trebuie sa cuprinda o referinta la prezenta norma sanitara veterinara sau trebuie sa fie acompaniate de astfel de referinte la momentul publicarii oficiale a acestora. Procedura pentru o astfel de referinta va fi adoptata de autoritatea veterinara centrala a Romaniei.
    Art. 3
    (1) Autoritatea veterinara centrala a Romaniei poate adopta, prin Ministerul Agriculturii, Padurilor, Apelor si Mediului, acte normative sau prevederi administrative suplimentare prezentei norme sanitare veterinare.
    (2) Autoritatea veterinara centrala a Romaniei, prin Ministerul Agriculturii, Padurilor, Apelor si Mediului, va lua masurile necesare si va sanctiona, potrivit legii, orice incalcare a prevederilor prezentei norme sanitare veterinare.
    (3) Autoritatea veterinara centrala a Romaniei va lua masurile necesare si va sanctiona, potrivit legii, orice incalcare a prevederilor prezentei norme sanitare veterinare.
    Art. 4
    Anexa face parte integranta din prezenta norma sanitara veterinara.

    ANEXA 1
    la norma sanitara veterinara

    PARTEA A
    Determinarea vitaminei A (retinol)

    1. Scop si domeniu
    Aceasta metoda se foloseste pentru determinarea vitaminei A (retinol) din furaje si premixuri. Vitamina A include toti compusii alcool trans-retinol si izomerii cis ce sunt determinati prin aceasta metoda. Continutul de vitamina A este exprimat in unitati internationale (UI)/kg. O unitate internationala corespunde activitatii a 0,300 micrograme a tuturor compusilor alcoolici trans ai vitaminei A sau 0,344 micrograme a tuturor compusilor acetati trans ai vitaminei A ori 0,550 micrograme a tuturor compusilor palmitati trans ai vitaminei A. Limita de determinare este de 2.000 UI vitamina A/kg.

    2. Principiu
    Proba este hidrolizata cu solutie etanolica de hidroxid de potasiu, iar vitamina A este extrasa in eter de petrol. Solventul este inlaturat prin evaporare, iar reziduul este diluat in metanol si, daca este necesar, diluat pana la concentratia necesara. Continutul de vitamina A este determinat prin lichid cromatografie de inalta performanta cu faza inversa (RP-HPCL), folosindu-se un detector cu UV sau cu fluorescenta. Parametrii cromatografici sunt alesi astfel incat sa nu existe nici o diferenta intre toti compusii alcoolici trans ai vitaminei A si izomerii cis.

    3. Reactivi:
    3.1. Etanol, s = 96%
    3.2. Petrol usor, interval de fierbere 40 grade la 60 grade C
    3.3. Metanol
    3.4. Solutie de hidroxid de potasiu, beta = 50 g/100 ml
    3.5. Solutia de ascorbat de sodiu, beta = 10 g/100 ml (a se vedea observatiile de la pct. 7.7)
    3.6. Sulfit de sodiu, Na2S * H2O (x = 7 - 9)
    3.6.1. Solutie de sulfit de sodiu, c = 0,5 mol/l in glicerol, beta = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observatiile de la pct. 7.8)
    3.7. Solutie de fenoftaleina, beta = 2 g/100 ml in etanol (pct. 3.1)
    3.8. 2-Propanol
    3.9. Faza mobila pentru HPLC: amestec de metanol (pct 3.3) si apa, de exemplu 980 + 20 (v + v). Raportul exact trebuie determinat prin intermediul caracteristicilor coloanei folosite.
    3.10. Azot, liber de oxigen
    3.11. Solutie stoc din retinol acetat trans total: se cantaresc, cu aproximatie de 0,1 mg, 50 mg din acetat de vitamina A intr-un balon de 100 ml. Se dizolva in 2-propanol (pct. 3.8) si se completeaza pana la semn cu acelasi solvent. Concentratia nominala a acestei solutii este de 1.400 UI vitamina A/ml. Continutul exact trebuie determinat in conformitate cu pct. 5.6.3.2.
    3.12. Palmitat de vitamina A, extrapur, cu activitate certificata, de exemplu 1,80 x 10^6 UI/g
    3.12.1. Solutie stoc din retinol palmitat trans total: se cantaresc, cu aproximatie de 0,1 mg, 80 mg din palmitat de vitamina A (pct. 3.12) intr-un balon cotat de 100 ml. Se dizolva in 2-propanol (pct. 3.8) si se completeaza pana la semn cu acelasi solvent. Concentratia nominala a acestei solutii este de 1.400 UI vitamina A/ml. Continutul exact trebuie determinat in conformitate cu pct. 5.6.3.2.
    3.13. 2,6-di-tert-butil-4-metilfenol (BHT) (a se vedea observatiile de la pct. 7.5).

    4. Aparatura:
    4.1. Evaporator rotator cu vacuum
    4.2. Sticlarie bruna
    4.2.1. Baloane conice cu fund plat de 500 ml, cu slif
    4.2.2. Baloane cotate cu dopuri rodate, cu gat stramt, cu capacitate de 10, 25, 100 si 500 ml
    4.2.3. Palnii de separare, conice, de 1.000 ml, cu dopuri din sticla
    4.2.4. Baloane de 250 ml
    4.3. Condensator Allihn, cu lungimea invelisului de 300 mm
    4.4. Hartie de filtru pentru separarea fazica, cu diametrul de 185 mm (de exemplu Schleicher & Schuell 597 HY1/2 sau similar)
    4.5. Lichid cromatografie de inalta presiune (echipament HPLC cu sistem de injectie)
    4.5.1. Coloana de lichid cromatografie, 250 mm x 4 mm, C18, de 5 sau 10 micrometri sau echivalent (criteriu de performanta: doar un singur peak pentru toti izomerii retinolului in baza conditiilor HPLC)
    4.5.2. Detector UV sau de fluorescenta, cu ajustare variabila a lungimii de unda
    4.6. Spectrofotometru cu cuve de cuart de 10 mm;
    4.7. Baie de apa cu agitator magnetic
    4.8. Aparat de extractie ce consta din:
    4.8.1. cilindru de sticla cu capacitate de 1 l, echipat cu gat si dop rodat;
    4.8.2. mufa rodata, echipata cu un brat exterior si un tub ajustabil ce trece prin centru. Tubul ajustabil trebuie sa aiba un capat in forma de U in partea de jos si o parte efilata la partea opusa, astfel incat stratul superior de lichid din cilindru sa poata fi transferat intr-un tub de separare.

    5. Procedura
    NOTA:
    Vitamina A este sensibila la lumina (UV) si oxidare. Toate operatiunile trebuie efectuate in absenta luminii (folosindu-se sticlarie bruna sau sticlarie protejata cu folie de aluminiu) si a oxigenului (a se purja cu azot). In timpul extractiei aerul de deasupra lichidului trebuie inlocuit cu azot (evitati presiunea in exces prin largirea dopului din cand in cand).
    5.1. Pregatirea probei
    Se marunteste proba astfel incat sa treaca printr-o sita cu ochiuri de 1 mm, avandu-se grija sa se evite generarea de caldura. Maruntirea trebuie efectuata imediat inainte de cantarire si saponificare, altfel ar putea avea loc pierderi de vitamina A.
    5.2. Saponificarea
    In functie de continutul de vitamina A, se cantaresc (cu aproximatie de 0,01 g) 2 pana la 25 g din proba, intr-un balon cu fund plat sau conic (pct. 4.2.1). Se adauga in continuare, prin amestecare, 130 ml etanol (pct. 3.1), aproximativ 100 mg BHT (pct. 3.13), 2 ml de solutie de sulfit de sodiu (pct. 3.6). Se potriveste un condensator (pct. 4.3) la balon si se scufunda balonul intr-o baie de apa cu agitator mecanic (pct. 4.7). Se incalzeste pana la fierbere si se lasa la reflux timp de 5 minute. Se adauga apoi 25 ml solutie de hidroxid de potasiu (pct. 3.4) prin condensator (pct. 4.3) si se lasa la reflux timp de inca 25 de minute, agitandu-se sub un flux usor de azotat. Se clateste apoi condensatorul cu aproximativ 20 ml de apa si se raceste continutul balonului la temperatura camerei.
    5.3. Extractie
    Se transfera prin decantare intreaga solutie saponificata, prin clatire cu un volum total de 250 ml apa pana la 1.000 ml a palniei de separare (pct. 4.2.3) sau a aparatului de extractie (pct. 4.8). Se clateste balonul de saponificare in continuare cu 25 ml etanol (pct. 3.1) si 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) si se transfera solutiile de clatire in palnia de separare sau in aparatul de extractie. Proportia de apa si etanol in solutiile combinate ar trebui sa fie de 2:1. Se scutura viguros timp de doua minute si se lasa sa se sedimenteze timp de doua minute.
    5.3.1. Extractie folosind un tub de separare (pct. 4.2.3)
    Cand straturile de lichid s-au separat (a se vedea observatia de la pct. 7.3), se transfera stratul de eter de petrol intr-o alta palnie de separare (pct. 4.2.3). Se repeta aceasta extractie de doua ori, cu 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) si de doua ori cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2).
    Se spala extractele combinate in palnia de separare, de doua ori, prin amestecare usoara - pentru a se evita formarea emulsiilor - cu cantitati de 100 ml apa si apoi cu cantitati de 100 ml apa, cu agitare repetata, pana cand apa ramane incolora la adaugarea solutiei de fenoftaleina (pct. 3.7) - spalarea de patru ori este suficienta -. Se filtreaza extractul spalat printr-un filtru de hartie pentru separare fazica (pct. 4.4), pentru a se inlatura orice cantitate de apa in suspensie, intr-un balon cotat de 500 ml (pct. 4.2.2). Se spala palnia de separare si filtrul cu 50 ml eter de petrol, se umple pana la semn cu eter de petrol (pct. 3.2) si se amesteca bine.
    5.3.2. Extractie folosind un aparat de extractie (pct. 4.8)
    Cand straturile s-au separat (a se vedea observatia de la pct. 7.3), se inlocuieste dopul cilindrului de sticla (pct. 4.8.1) prin insertie din sticla mata (pct. 4.8.2) si se aranjeaza capatul de mai jos in forma de U al tubului ajustabil, astfel incat sa se afle deasupra nivelului interfetei. Prin aplicarea unei presiuni de la generatorul de azot prin bratul exterior, se transfera stratul superior de eter de petrol intr-un tub de separare de 1.000 ml (pct. 4.2.3). Se adauga 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) intr-un cilindru de sticla, se ataseaza dopul si se agita bine. Se lasa straturile sa se separe si se transfera stratul de deasupra in tubul de separare, la fel ca inainte. Se repeta procedura extractiei cu inca 100 ml eter de petrol (pct. 3.2), apoi de doua ori cu cantitati de 50 ml eter de petrol (pct. 3.2) si se adauga straturile de eter de petrol in tubul de separare.
    Se spala extractele combinate din eter de petrol, dupa cum este descris la pct. 5.3.1, si se procedeaza dupa cum este descris la acel punct.
    5.4. Prepararea solutiei proba pentru HPLC
    Se pipeteaza o cantitate alicota din solutia de eter de petrol (de la pct. 5.3.1 la pct. 5.3.2) intr-un balon in forma de para de 250 ml (pct. 4.2.4). Se evapora solventul pana aproape de uscare, pe evaporatorul rotativ (pct. 4.1), cu presiune redusa, la o temperatura a baii ce nu depaseste 40 grade C. Se restabileste presiunea atmosferica prin admisie de nitrogen (pct. 3.10) si se indeparteaza balonul de pe evaporatorul rotativ. Se inlatura solventul ramas printr-un curent de azot (pct. 3.10) si se dizolva imediat reziduul cu un volum cunoscut (10 - 100 ml) de metanol (pct. 3.3) (concentratia de vitamina A trebuie sa fie intre 5 UI/ml si 30 UI/ml).
    5.5. Determinare prin HPLC
    Vitamina A este separata pe o coloana cu faza inversata de C18 (pct. 4.5.1), iar concentratia este masurata printr-un detector de UV (325 nm) sau un detector de fluorescenta (excitatie: 325 nm, emisie: 475 nm) (pct. 4.5.2).
    Se injecteaza o cantitate alicota (de exemplu 20 microlitri) de solutie metanolica obtinuta conform pct. 5.4 si se realizeaza o elutie cu faza mobila (pct. 3.9). Se calculeaza media peak-urilor inaltimii mai multor injectii din aceeasi solutie de proba si media peak-urilor inaltimii mai multor injectii ale solutiilor de calibrare (pct. 5.6.2).
    Conditii de separare HPLC
    Sunt oferite urmatoarele conditii pentru instruire; pot fi folosite alte conditii, cu obligatia ca acestea sa ofere rezultate echivalente.
    Coloana de lichid cromatografie (pct. 4.5.1): 250 mm x 4 mm, C18 de 5 sau 10 micrometri ori echivalent
    Faza mobila (pct. 3.9): amestec de metanol (pct. 3.3) si apa, de exemplu 980 + 20 (v + v)
    Rata de curgere: 1 - 2 ml/min.
    Detector (pct. 4.5.2): detector cu UV (325 nm) sau detector cu fluorescenta (excitatie: 325 nm/emisie: 475 nm)
    5.6. Calibrare
    5.6.1. Prepararea solutiilor standard de lucru
    Se pipeteaza 20 ml solutie de acetat vitamina A (pct. 3.11) sau 20 ml solutie stoc de palmitat vitamina A (pct. 3.12.1) intr-un balon cu fund plat sau conic (pct. 4.2.1) si se hidrolizeaza dupa cum este descris la pct. 5.2, dar fara a se adauga BHT. Se aplica apoi extractia cu eter de petrol (pct. 3.2) in conformitate cu pct. 5.3 si se completeaza pana la 500 ml cu eter de petrol (pct. 3.2). Se evapora 100 ml din acest extract pe evaporatorul rotativ (a se vedea pct. 5.4) pana aproape de uscare, se inlatura solventul ramas cu un curent de azot (pct. 3.10) si se redizolva reziduul in 10,0 ml metanol (pct. 3.3). Concentratia nominala a acestei solutii este 560 UI vitamina A/ml. Continutul exact trebuie determinat in conformitate cu pct. 5.6.3.3. Solutia standard de lucru trebuie preparata proaspata, inainte de folosire. Se pipeteaza 2,0 ml din aceasta solutie standard de lucru, intr-un balon gradat, se completeaza cu metanol pana la semn (pct. 3.3) si se amesteca. Concentratia nominala a acestei solutii standard de lucru diluata este de 56 UI de vitamina A/ml.
    5.6.2. Prepararea solutiilor de calibrare si a graficului de calibrare: se transfera 1,0; 2,0; 5,0 si 10,0 ml din solutia standard de lucru, diluata intr-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completeaza pana la semn cu metanol (pct. 3.3) si se amesteca. Concentratiile nominale ale acestor solutii sunt 2,8; 5,6; 14,0 si 28,0 UI de vitamina A/ml. Se injecteaza 20 microlitri din fiecare solutie de calibrare de mai multe ori si se determina media inaltimilor peack-urilor. Folosindu-se media inaltimilor peack-urilor, se intocmeste un grafic de calibrare, luandu-se in considerare rezultatele controlului UV (pct. 5.6.3.3).
    5.6.3. Standardizarea UV a solutiilor standard
    5.6.3.1. Solutie acetat de vitamina A
    5.6.3.2. Se pipeteaza 2,0 ml din solutia acetat de vitamina A (pct. 3.11) intr-un balon gradat de 50 ml (pct. 4.2.2) si se completeaza pana la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentratia nominala a acestei solutii este de 56 UI vitamina A/ml. Se pipeteaza 3,0 ml din aceasta solutie de acetat vitamina A intr-un balon gradat de 25 ml si se completeaza pana la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentratia nominala a acestei solutii este de 6,72 UI vitamina A/ml. Se masoara spectrul UV al acestei solutii fata de 2-propanol (pct. 3.8) cu un spectrofotometru (pct. 4.6), la o lungime de unda intre 300 nm si 400 nm. Extinctia maxima trebuie sa fie intre 325 nm si 327 nm. Calcularea continutului de vitamina A:
                                         1%
    UI vitamina A/ml = E326 x 19,0 (E1 cm   pentru retinol acetat = 1.530 la 326 nm in 2-propanol)

    5.6.3.3. Solutie standard palmitat de vitamina A: se pipeteaza 3,0 ml din solutia standard de vitamina A nediluata, preparata in conformitate cu pct. 5.6.1, intr-un balon cotat de 50 ml (pct. 4.2.2) si se completeaza pana la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Se pipeteaza 5 ml din aceasta solutie intr-un balon cotat de 25 ml si se aduce la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentratia nominala a acestei solutii este de 6,72 UI de vitamina A/ml. Se masoara spectrul acestei solutii fata de 2-propanol (pct. 3.8) cu spectrofotometru (pct. 4.6) la lungime de unda intre 300 nm si 400 nm. Extinctia maxima trebuie sa fie intre 325 nm si 327 nm. Calcularea continutului in vitamina A:

    UI vitamina A/ml = E325 * 18,3
          1%
    (E1 cm   pentru retinol = 1.821 la 325 nm in 2-propanol)

    6. Calcularea rezultatelor
    Pornindu-se de la inaltimea medie a peak-urilor de vitamina A a solutiei de proba, se determina concentratia solutiei de proba in UI/ml, prin referire la curba de calibrare (pct. 5.6.2).
    Continutul w de vitamina A in UI/kg ale probei este dat de urmatoarea formula:

        500 * beta * V2
    w = --------------- * 1000 [UI/kg],
             V1 * m

    in care:
    beta = concentratia de vitamina A din solutia de proba (pct. 5.4) la UI/ml;
    V1 = volumul solutiei de proba (pct. 5.4), in ml;
    V2 = volumul cantitatii alicote luate conform pct. 5.4, in ml;
    m = masa portiunii de testare, in g.

    7. Observatii
    7.1. Pentru probe cu concentratie redusa de vitamina A poate fi util sa se combine extractele de eter de petrol din doua incarcaturi de saponificare (cantitate cantarita = 25 g) intr-o solutie de proba pentru determinare HPLC.
    7.2. Greutatea probei utilizate pentru analiza nu ar trebui sa contina mai mult de 2 g grasime.
    7.3. Daca separarea fazica nu are loc, adaugati aproximativ 10 ml etanol (pct. 3.1) pentru a intrerupe emulsia.
    7.4. Pentru ulei din ficat de cod si alte grasimi pure timpul de saponificare trebuie sa fie extins la 45 - 60 de minute.
    7.5. Poate fi folosita hidrochinona in loc de BHT.
    7.6. Folosindu-se o coloana fazica normala, este posibila separarea de izomeri de retinol.
    7.7. Se pot folosi aproximativ 150 mg de acid ascorbic in loc de solutie de ascorbat de sodiu.
    7.8. Se pot folosi aproximativ 50 mg EDTA in loc de solutia de sulfit de sodiu.

    8. Repetabilitate
    Diferenta dintre rezultatele a doua determinari paralele, efectuate pe aceeasi proba, nu trebuie sa depaseasca 15%, cu referire la cel mai bun rezultat.

    9. Rezultate ale unui studiu de colaborare*)
___________________________________________________________________
         Premix         Furaj cu      Concentrat   Furaj     Purcel
                        premix        mineral      proteic
___________________________________________________________________
L        13             12                   13        12      13
___________________________________________________________________
n        48             45                   47        46      49
___________________________________________________________________
medie
[UI/kg]  17,02 * 10^6    1,21 * 10^6     537100    151800   18070
___________________________________________________________________
sr
[UI/kg]   0,51 * 10^6    0,039 * 10^6     22080     12280     682
___________________________________________________________________
r
[UI/kg]   1,43 * 10^6    0,109 * 10^6     61824     34384    1910
___________________________________________________________________
CVr[%]    3,0            3,5                  4,1       8,1     3,8
___________________________________________________________________
sR
[UI/kg]   1,36 * 10^6    0,069 * 10^6     46300     23060    3614
___________________________________________________________________
R
[UI/kg]   3,81 * 10^6    0,193 * 10^6    129640     64568   10119
___________________________________________________________________
CVR
[%]       8,0            6,2                  8,6      15      20
___________________________________________________________________
L:   numar de laboratoare
n:   numar de valori singulare
sr:  deviatia standard a repetabilitatii
sR:  deviatia standard a reproductibilitatii
r:   repetabilitate
R:   reproductibilitate
CVr: coeficient de variatie al repetabilitatii
CVR: coeficient de variatie al reproductibilitatii
___________________________________________________________________
    *) Realizat de grupul de lucru pentru furaje din Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs-und Forschungsanstalten (VDLUFA).

    PARTEA B
    Determinarea vitaminei E (tocoferol)

    1. Scop si domeniu
    Aceasta metoda se foloseste pentru determinarea vitaminei E din furaje si premixuri. Continutul de vitamina E este exprimat ca mg de DL acetat de tocoferol/kg. Astfel, 1 mg DL acetat de tocoferol corespunde la 0,91 mg DL tocoferol (vitamina E).
    Limita de determinare este de 2 mg vitamina E/kg.

    2. Principiu
    Proba este hidrolizata cu solutie de hidroxid de potasiu etanolic, iar vitamina E este extrasa in eter de petrol. Solventul este inlaturat prin evaporare, iar reziduul este dizolvat in metanol si, daca este necesar, diluat pana la concentratia necesara. Continutul de vitamina E este determinat prin lichid cromatografie de inalta performanta cu faza inversata (RP-HPLC), folosindu-se un detector cu fluorescenta sau UV.

    3. Reactivi
    3.1. Etanol, s = 96%
    3.2. Eter de petrol, fractia 40 grade C - 60 grade C
    3.3. Metanol
    3.4. Solutie de hidroxid de potasiu, beta = 50 g/100 ml
    3.5. Solutie de ascorbat de sodiu, beta = 10 g/100 ml (a se vedea observatiile de la pct. 7.7)
    3.6. Sulfit de sodiu, Na2S x H2O (x = 7 - 9)
    3.6.1. Solutie de sulfit de sodiu, c = 0,5 mol/l in glicerol, beta = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observatiile de la pct. 7.8)
    3.7. Solutie de fenolftaleina, beta = 2 g/100 ml in etanol (pct. 3.1)
    3.8. Faza mobila pentru HPLC: amestec de metanol (pct. 3.3) si apa, de exemplu: 980 + 20 (v + v). Raportul exact trebuie sa fie determinat prin intermediul caracteristicilor coloanei folosite.
    3.9. Azot, liber de oxigen
    3.10. DL-alfa-tocoferol acetat, extrapur, cu activitate certificata
    3.10.1. Solutie stoc din DL-a-acetat de tocoferol: se cantaresc, cu aproximatie de 0,1 mg, 100 mg DL-a-acetat de tocoferol (pct. 3.10) intr-un balon gradat de 100 ml. Se dizolva in etanol (pct. 3.1) si se completeaza pana la semn cu acelasi solvent. Astfel, 1 ml din aceasta solutie contine 1 mg DL-a-acetat de tocoferol (pentru control UV, a se vedea pct. 5.6.2.3; pentru stabilizare, a se vedea observatiile de la pct. 7.4)
    3.11. DL-alfa-tocoferol, extrapur, cu activitate certificata
    3.11.1. Se cantaresc, cu aproximatie de 0,1 mg, 100 mg de DL-alfa-tocoferol (pct. 3.10), intr-un balon gradat de 100 ml. Se dizolva in etanol (pct. 3.1) si se completeaza pana la semn cu acelasi solvent. Astfel, 1 ml din aceasta solutie contine 1 mg DL-alfa-tocoferol (pentru control UV, a se vedea pct. 5.6.2.3; pentru stabilizare, a se vedea observatiile de la pct. 7.4)
    3.12. 2,6 di-tert-butil-metilfenol (BHT) (a se vedea observatiile de la pct. 7.5).

    4. Aparatura
    4.1. Evaporator rotativ cu vacuum
    4.2. Sticlarie bruna
    4.2.1. Baloane cu fund plat sau conice de 500 ml, cu slif
    4.2.2. Baloane cotate, cu dopuri rodate, cu gat stramt, cu capacitate de 10, 25, 100 si 500 ml
    4.2.3. Palnii de separare conice, de 1.000 ml, cu dopuri de sticla
    4.2.4. Baloane de 250 ml
    4.3. Condensator Allihn, de 300 mm, cu legatura din sticla, cu adaptator pentru o pipa de aprovizionare cu gaz
    4.4. Hartie de filtru pentru separare fazica, cu diametrul de 185 mm (de exemplu Schleicher & Schuell 597 HY 1/2 sau similar).
    4.5. Echipament HPLC cu sistem de injectie
    4.5.1. Coloana de lichid cromatografie, 250 mm x 4 mm, C18, de 5 ori 10 micrometri sau echivalent
    4.5.2. Detector UV sau de fluorescenta, cu ajustare variabila a lungimii de unda
    4.6. Spectrofotometru cu cuve de cuart de 10 mm
    4.7. Baie de apa cu agitator magnetic
    4.8. Aparat de extractie constand din:
    4.8.1. Cilindru de sticla, de capacitate de 1 l, caruia i se pun un gat si dop de sticla
    4.8.2. Mufa din sticla mata, echipata cu un brat exterior si cu un tub ajustabil ce trece prin centru. Tubul ajustabil trebuie sa aiba un capat in forma de U situat in partea de jos si un capat efilat la partea opusa, astfel incat stratul superior de lichid din cilindru sa poata fi transferat intr-o palnie de separare.

    5. Procedura
    NOTA:
    Vitamina E este sensibila la lumina (UV) si oxidare. Toate operatiunile trebuie efectuate in absenta luminii (folosindu-se sticlarie bruna sau sticlarie protejata cu folie de aluminiu) si a oxigenului (a se spala cu azot). In timpul extractiei, aerul de deasupra lichidului trebuie inlocuit de azot (a se evita presiunea, prin largirea dopului din cand in cand)
    5.1. Pregatirea probei: se marunteste proba astfel incat sa treaca printr-o sita cu ochiuri de 1 mm, avandu-se grija sa se evite generarea de caldura. Maruntirea trebuie efectuata imediat inainte de cantarire si saponificare, altfel pot avea loc pierderi de vitamina E.
    5.2. Saponificare: in functie de continutul de vitamina E, se cantaresc, cu aproximatie de 0,01 g, 2 pana la 25 g din proba, intr-un balon de 500 ml cu fundul plat sau conic (pct. 4.2.1). Se adauga in continuare, prin amestecare, 130 ml etanol (pct. 3.1), aproximativ 100 mg BHT (pct. 3.12), 2 ml solutie de ascorbat de sodiu (pct. 3.5) si 2 ml solutie de sulfit de sodiu (pct. 3.6). Se potriveste un condensator (pct. 4.3) la balon si se scufunda balonul intr-o baie de apa cu agitator mecanic (pct. 4.7). Se incalzesc pana la fierbere si se lasa la reflux timp de 5 minute. Se adauga apoi 25 ml solutie de hidroxid de potasiu (pct. 3.4) prin condensator (pct. 4.3) si se lasa la reflux timp de 25 de minute, agitandu-se sub un flux usor de azot. Apoi se clateste condensatorul cu aproximativ 20 ml apa si se raceste continutul balonului la temperatura camerei.
    5.3. Extractie: se transfera, prin decantare, intreaga solutie de saponificare, prin clatire cu un volum total de 250 ml apa pana la 1.000 ml, a palniei de separare sau a aparatului de extractie (pct. 4.8). Se clateste balonul de saponificare, in continuare, cu 25 ml etanol (pct. 3.1) si 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) si se transfera solutiile de clatire in tubul de separare sau in aparatul de extractie. Proportia de apa si etanol in solutiile combinate trebuie sa fie 2:1. Se scutura viguros timp de doua minute si se lasa sa se sedimenteze timp de doua minute.
    5.3.1. Extractie folosind un tub de separare (pct. 4.2.3); cand straturile de lichid s-au separat (a se vedea pct. 7.3), se transfera stratul de eter de petrol intr-un alt tub separator (pct. 4.2.3). Se repeta aceasta extractie de doua ori cu 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) si de doua ori cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2). Se spala extractele combinate in tubul de separare, de doua ori, prin amestecare usoara (pentru a se evita formarea emulsiilor), cu cantitati de 100 ml apa si apoi cu cantitati de 100 ml apa, cu agitare repetata, pana cand apa ramane incolora la adaugarea solutiei de fenolftaleina (pct. 3.7) (spalarea de 4 ori este de obicei suficienta). Se filtreaza extractul spalat printr-un filtru impaturit, pentru separare fazica (pct. 4.4), pentru a se inlatura orice cantitate de apa in suspensie, intr-un balon gradat de 500 ml (pct. 4.2.2). Se spala tubul de separare si filtrul cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2), se umple pana la semn cu eter de petrol (pct. 3.2) si se amesteca bine.
    5.3.2. Extractie folosind un aparat de extractie (pct. 4.8); cand straturile s-au separat (a se vedea observatia de la pct. 7.3) se inlocuieste dopul cilindrului de sticla (pct. 4.8.1) printr-o insertie din sticla (pct. 4.8.2) si se aranjeaza capatul de jos in forma de U al tubului ajustabil, astfel incat sa se afle deasupra nivelului interfetei. Prin aplicarea unei presiuni de la generatorul nitrogenului, prin bratul exterior, se transfera stratul superior de eter de petrol intr-un tub de separare de 1.000 ml (pct. 4.2.3). Se adauga 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) in cilindrul de sticla, se ataseaza dopul si se agita bine. Se lasa straturile sa se separe si se transfera stratul de deasupra in tubul de separare, ca si mai inainte. Se repeta procedura extractiei cu inca 100 ml eter de petrol (pct. 3.2), apoi de doua ori cu cantitati de 50 ml eter de petrol (pct. 3.2) si se adauga straturi de eter de petrol tubului de separare. Se spala extractele combinate din eter de petrol, dupa cum este descris la pct. 5.3.1, si se procedeaza dupa cum este descris acolo.
    5.4. Prepararea solutiei proba pentru HPLC: se pipeteaza o cantitate alicota din solutia de eter de petrol (de la pct. 5.3.1 la pct. 5.3.2) intr-un balon in forma de para, de 250 ml (pct. 4.2.4). Se evapora solventul aproape de uscare pe evaporatorul rotativ (pct. 4.1) cu presiune redusa, la o temperatura a baii ce nu depaseste 40 grade C. Se readuce la presiunea atmosferica prin admisie de azot (pct. 3.9) si se indeparteaza balonul de pe evaporatorul rotativ. Se inlatura solventul ramas printr-un curent de azot (pct. 3.9) si se dizolva imediat reziduul cu un volum cunoscut (10 - 100 ml) de metanol (pct. 3.3) (concentratia de L-alfa-tocoferol trebuie sa fie intre 5 micrograme/ml si 30 micrograme/ml).
    5.5. Determinare prin HPLC: vitamina E este separata pe o coloana cu faza inversata de C18 (pct. 4.5.1), iar concentratia este masurata printr-un detector de fluorescenta (excitatie: 295 nm, emisie: 330 nm) sau un detector de UV (292 nm) (pct. 4.5.2). Se injecteaza o fractie alicota (de exemplu: 20 microlitri) de solutie metanolica obtinuta conform pct. 5.4 si se realizeaza o elutie cu faza mobila (pct. 3.8). Se calculeaza media inaltimii peak-ului mai multor injectii din aceeasi solutie de proba si mediile inaltimii peak-ului ale mai multor injectii ale solutiilor de calibrare (pct. 5.6.2). Conditii HPLC. Sunt oferite urmatoarele conditii pentru orientare; pot fi folosite alte situatii, cu conditia ca acestea sa ofere rezultate echivalente.
    Coloana de lichid cromatografie (pct. 4.5.1): 250 mm x 4 mm, C18, ambalaje de 5 ori 10 micrometri sau echivalent.
    Faza mobila (pct. 3.8): amestec de metanol (pct. 3.3) si apa, de exemplu: 980 + 20 (v + v)
    Rata de curgere: 1 - 2 ml/min.
    Detector (pct. 4.5.2): detector cu fluorescenta (excitatie: 5 nm/emisie: 330 nm) sau detector de UV (292 nm)
    5.6. Calibrare (DL acetat de tocoferol sau DL-alfa-tocoferol)
    5.6.1. DL acetat de tocoferol standard
    5.6.1.1. Prepararea solutiei standard de lucru
    Se transfera cu o pipeta 25 ml solutie de DL acetat de tocoferol (pct. 3.10.1), intr-un balon de 500 ml cu fund plat sau conic (pct. 4.2.1) si se hidrolizeaza dupa cum este descris la pct. 5.2, dar fara a se adauga BHT. Apoi se extrage cu eter de petrol (pct. 3.2), in concordanta cu pct. 5.3, si se completeaza pana la 500 ml cu eter de petrol (pct. 3.2). Se evapora 25 ml din acest extract, pe evaporatorul rotativ (a se vedea pct. 5.4) pana aproape de uscare, se inlatura solventul ramas cu un curent de nitrogen (pct. 3.9) si se redizolva reziduurile in 25,0 ml metanol (pct. 3.3). Concentratia nominala a acestei solutii este 45,5 micrograme DL-alfa-tocoferol/ml, echivalent cu 50 micrograme DL-alfa-tocoferol acetat/ml. Solutia standard de lucru trebuie preparata proaspata, inainte de folosire.
    5.6.1.2. Prepararea solutiilor de calibrare sau a graficului de calibrare: se transfera 1,0, 2,0, 4,0 si 10,0 ml din solutia standard de lucru, intr-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completeaza pana la semn cu metanol (pct. 3.3) si se amesteca. Concentratiile nominale ale acestor solutii sunt: 2,5; 5,0; 10,0 si 25,0 micrograme/ml DL-alfa-tocoferol acetat, de exemplu: 2,28, 4,55, 9,10 micrograme/ml DL-alfa-tocoferol. Se injecteaza 20 microlitri din fiecare solutie de calibrare, de mai multe ori, si se determina media inaltimii peak-ului. Folosindu-se mediile inaltimii peak-ului, se intocmeste un grafic de calibrare.
    5.6.1.3. Standardizarea UV a solutiei de tocoferol acetat (pct. 3.10.1)
    Se dizolva 5,0 ml solutie de tocoferol acetat (pct. 3.10.1) pana la 25,0 ml cu etanol si se masoara spectrul UV al solutiei fata de etanol (pct. 3.1), cu un spectrofotometru (pct. 4.6) la un lungime de unda intre 250 nm si 320 nm.
    Absorbtia maxima trebuie sa fie la 284 nm:

         1%
    E1 cm   = 43,6 la 284 nm in etanol

    La aceasta dilutie trebuie obtinuta o valoare de extinctie de aproximativ 0,84 - 0,88.
    5.6.2. DL-alfa-tocoferol standard
    5.6.2.1. Prepararea solutiei standard de lucru
    Se transfera, cu pipeta, 2,0 ml solutie de tocoferol acetat (pct. 3.11.1) intr-un balon cotat de 50 ml, se dizolva in metanol (pct. 3.3) si se completeaza pana la semn cu metanol. Concentratia nominala a acestei solutii este de 40 micrograme DL tocoferol acetat/ml, echivalent cu 44,0 micrograme de tocoferol acetat/ml. Solutia standard de lucru trebuie preparata proaspata inainte de folosire.
    5.6.2.2. Prepararea solutiilor de calibrare si a graficului de calibrare
    Se transfera 1,0; 2,0; 4,0 si 10,0 ml din solutia standard de lucru diluata, intr-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completeaza pana la semn cu metanol (pct. 3.3) si se amesteca.
    Concentratiile nominale ale acestor solutii sunt: 2,0; 4,0; 8,0 si 20,0 micrograme/ml si 22,0 micrograme/ml tocoferol acetat. Se injecteaza 20 microlitri din fiecare solutie de calibrare de mai multe ori si se determina mediile inaltimii peak-ului. Folosindu-se mediile inaltimii peak-ului, se intocmeste un grafic de calibrare.
    5.6.2.3. Standardizarea UV a solutiei DL-alfa-tocoferol (pct. 3.11.1)
    Se dizolva 2,0 ml pana la 25,0 ml din solutia stoc de tocoferol (pct. 3.11.1) cu etanol (pct. 3.1) si se masoara spectrul UV al acestei solutii fata de etanol, cu spectrofotometru (pct. 4.6) la lungime de unda intre 250 nm si 320 nm.
    Absorbtia maxima trebuie sa fie la 292 nm:

         1%
    E1 cm   = 75,8 la 292 nm in etanol

    La aceasta dilutie trebuie obtinuta o valoare de extinctie de 0,6.

    6. Calcularea rezultatelor
    Pornindu-se de la media inaltimii peak-ului pentru vitamina E a solutiei de proba, se determina concentratia solutiei de proba in micrograme/ml (calculata ca alfa-tocoferol acetat) prin referire la graficul de calibrare (pct. 5.6.1.2 sau 5.6.2.2).
    Continutul w de vitamina E in mg/kg de proba este dat de urmatoarea formula:

    w = 500 x beta x V2 [mg/kg] / V1 x m,

    in care:
    beta = concentratia de vitamina E din solutia de proba (pct. 5.4) in UI/ml;
    V1 = volumul solutiei de proba (pct. 5.4), in micrograme/ml;
    V2 = volumul cantitatii alicote folosite la pct. 5.4, in ml;
    m = masa portiunii de testat, in g.

    7. Observatii
    7.1. Pentru probe cu concentratie redusa de vitamina E poate fi util sa se combine extractele de eter de petrol din doua incarcaturi de saponificare (cantitate cantarita: 25 g) intr-o solutie de proba, pentru determinare HPLC.
    7.2. Greutatea probei utilizate pentru analiza nu ar trebui sa contina mai mult de 2 g grasime.
    7.3. Daca separarea fazica nu are loc, se adauga aproximativ 10 ml l etanol (pct. 3.1), pentru a intrerupe emulsia.
    7.4. Dupa masurarea cu spectrofotometrul a solutiei de tocoferol acetat sau DL-alfa-tocoferol, in conformitate cu pct. 5.6.1.3 sau 5.6.2.3, se adauga aproximativ 10 mg BHT (pct. 3.12) la solutie (3.10.1 sau 3.10.2) si se pastreaza solutia la frigider (perioada de pastrare de maximum 4 saptamani).
    7.5. Poate fi folosita hidrochinona in loc de BHT.
    7.6. Folosindu-se o coloana fazica normala, este posibila separarea unui a-, beta-, Y si d-tocoferol.
    7.7. Se pot folosi aproximativ 150 mg acid ascorbic in loc de solutie de ascorbat de sodiu.
    7.8. Se pot folosi aproximativ 50 mg EDTA in loc de solutie de sulfit de sodiu.

    8. Repetabilitate
    Diferenta dintre rezultatele a doua determinari paralele, efectuate pe aceeasi proba, nu trebuie sa depaseasca 15%, cu referire la cel mai bun rezultat.

    9. Rezultatele unui studiu de colaborare*)
___________________________________________________________
            Premix   Furaj cu   Concentrat  Furaj    Purcel
                     premix     mineral     proteic
___________________________________________________________
L              12      12        12          12      12
___________________________________________________________
n              48      48        48          48      48
___________________________________________________________
medie
[UI/kg]     17380    1187       926         315      61,3
___________________________________________________________
sR [UI/kg]    384      45,3      25,2        13,0     2,3
___________________________________________________________
r [UI/kg]    1075     126,8      70,6        36,4     6,4
___________________________________________________________
CVr[%]          2,2     3,8       2,7          4,1    3,8
___________________________________________________________
SR [UI/kg]    830      65,0      55,5         18,9    7,8
___________________________________________________________
R [UI/kg]    2324     182,0     155,4         52,9   21,8
___________________________________________________________
CVR[%]          4,8     5,5       6,0          6,0   12,7
___________________________________________________________
L:   numar de laboratoare
n:   numar de valori singulare
sr:  deviatia standard a repetabilitatii
sR:  deviatia standard a reproductibilitatii
r:   repetabilitate
R:   reproductibilitate
CVr: coeficient de variatie al repetabilitatii
CVR: coeficient de variatie al reproductibilitatii
___________________________________________________________
    *) Realizat de grupul de lucru pentru furaje din Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs-und Forschungsanstalten (VDLUFA).

    PARTEA C
    Determinarea triptofanului

    1. Scop si domeniu
    Aceasta metoda se foloseste pentru determinarea cantitatii totale si libere de triptofan din furaje. Nu se face distinctie intre formele D si L.

    2. Principiu
    Pentru determinarea triptofanului total, proba este hidrolizata in conditii alcaline cu solutie saturata de hidroxid de bariu si incalzita la 110 grade C, pentru 20 de ore. Dupa hidroliza se adauga standardul intern. Pentru determinarea triptofanului liber proba este extrasa in conditii de aciditate usoara, in prezenta standardului intern. Triptofanul si standardul intern din hidrolizat sau din extract sunt determinate prin HPLC cu detectare cu fluorescenta.

    3. Reactivi
    3.1. Trebuie folosita apa dublu distilata sau apa de calitate echivalenta (conductivitate < 10 micro S/cm)
    3.2. Substanta standard: triptofan (puritate/continut > 99%), uscata sub vacuum pe pentoxid de fosfor
    3.3. Substanta standard intern: a-metil-triptofan (puritate/continut > 99%), uscata sub vacuum pe pentoxid de fosfor
    3.4. Hidroxid de bariu octahidrat (trebuie avut grija pentru a nu se expune Ba(OH)2 x 8H2O excesiv la aer, pentru a se evita formarea de BaCO3 ce ar putea afecta determinarea) (a se vedea observatia de la pct. 9.3)
    3.5. Hidroxid de sodiu
    3.6. Acid ortofosforic, w = 85%
    3.7. Acid clorhidric, 20 = 1,19 g/ml
    3.8. Metanol, grade HPLC
    3.9. Eter de petrol, domeniu de fierbere 40 - 60 grade C
    3.10. Solutie de hidroxid de sodiu, c = 1 mol/l
    Se dizolva 40,0 g NaOH (pct. 3.5) in apa si se completeaza cu apa pana la 1 l (pct. 3.1)
    3.11. Acid clorhidric, c = 6 mol/l. Se iau 492 ml HCL (pct. 3.7) si se completeaza cu apa pana la 1 l.
    3.12. Acid clorhidric, c = 1 mol/l. Se iau 82 ml HCL (pct. 3.7) si se completeaza cu apa pana la 1 l.
    3.13. Acid clorhidric, c = 0,1 mol/l. Se iau 8,2 ml HCL (pct. 3.7) si se completeaza cu apa pana la 1 l.
    3.14. Acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l. Se iau 34 ml acid ortofosforic (pct. 3.6) si se completeaza cu apa pana la 1 l (pct. 3.1).
    3.15. Solutie concentrata de triptofan (pct. 3.2), c = 2,50 micromol/ml: intr-un balon volumetric de 500 ml se dizolva 0,2553 g triptofan (pct. 3.2) in acid clorhidric (pct. 3.13) si se completeaza pana la semn cu acid clorhidric (pct. 3.13). Se depoziteaza la 18 grade C pentru maximum 4 saptamani.
    3.16. Solutie concentrata standard intern, c = 2,50  micromol/ml.
    Intr-un balon volumetric de 500 ml se dizolva 0,2728 g a-metil-triptofan (pct. 3.3) in acid clorhidric (pct. 3.13) si se completeaza pana la semn cu acid clorhidric (pct. 3.13). Se depoziteaza la -18 grade C pentru maximum 4 saptamani.
    3.17. Solutie de triptofan standard de calibrare si standard intern: se iau 2,00 ml solutie concentrata de triptofan (pct. 3.15) si 2,00 ml solutie standard intern concentrat (a-metil-triptofan) (pct. 3.16). Se dilueaza cu apa (pct. 3.1) si metanol (pct. 3.8) cu aproximativ acelasi volum si pana la aproximativ aceeasi concentratie de metanol (10 - 30%) ca si hidrolizatul finisat. Solutia standard trebuie preparata proaspata inainte de folosire.
    3.18. Acid acetic
    3.19. 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol
    3.20. Etanolamina > 98%
    3.21. Solutie de 1 g - 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (pct. 3.19) in 100 ml metanol (pct. 3.8)
    3.22. Faza mobila pentru HPLC: 3,00 g acid acetic (pct. 3.18) + 900 ml apa (pct. 3.1) + 50,0 ml solutie (pct. 3.21) de 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (pct. 3.19) in metanol (pct. 3.8) (1 g/100 ml). Se ajusteaza pH-ul la 5,00, folosindu-se etanolamina (pct. 3.20). Se completeaza pana la 1.000 ml cu apa (pct. 3.1).

    4. Aparatura
    4.1. Echipament HPLC cu un detector spectrofluorimetric
    4.2. Coloana de lichid cromatografie, 125 mm x 4 mm, C18, in ambalaje de 3 micrometri sau echivalent
    4.3. pH-metru
    4.4. Balon de polipropilena, capacitate 125 ml, cu gat larg si dop cu surub
    4.5. Filtru de membrana, 0,45 micrometri
    4.6. Autoclava, 110 de bar (-2). 0 C, 1,4 (-0,1)
    4.7. Agitator mecanic sau agitator magnetic
    4.8. Mixer cu vortex

    5. Procedura
    5.1. Prepararea probelor
    Proba trebuie sa treaca printr-o sita de 0,5 mm. Probele cu umiditate ridicata trebuie sa fie uscate in aer, la o temperatura ce nu depaseste 50 grade C sau uscate cu gheata, inainte de maruntire. Probele cu continut ridicat de grasimi trebuie extrase cu eter de petrol (pct. 3.9) inainte de maruntire.
    5.2. Determinarea triptofanului liber (extract)
    Se cantareste, cu aproximatie de 1 mg, o cantitate adecvata (1 - 5 g) din proba preparata (pct. 5.1) intr-un balon conic. Se adauga 100,0 ml acid clorhidric, c = 0,1 mol/l (pct. 3.13) si 5,00 ml din solutie standard interna concentrata (pct. 3.16). Se agita sau se amesteca timp de 60 de minute, folosindu-se un agitator mecanic sau un agitator magnetic (pct. 4.7). Se permite sedimentului sa se depuna si se pipeteaza 10,0 ml din solutia de supernatant intr-un pahar de laborator. Se adauga suficient metanol (pct. 3.8) pentru a se realiza o concentratie intre 10 si 30% de metanol volum final. Se transfera intr-un balon volumetric de volum corespunzator si se dilueaza cu apa pana la un volum necesar pentru cromatografie (aproximativ acelasi volum ca si solutia de calibrare standard (pct. 3.17).
    Se filtreaza cativa ml de solutie printr-un filtru de membrana de 0,45 micrometri (pct. 4.5), inaintea injectarii pe coloana HPLC. Se trece la etapa cromatografiei, in conformitate cu pct. 5.4. Se protejeaza solutia standard si extrasele fata de lumina directa a soarelui. Daca nu este posibil sa se analizeze extractele in aceeasi zi, acestea pot fi pastrate la 5 grade C pentru maximum 3 zile.
    5.3. Determinarea triptofanului total (hidrolizat)
    Se cantareste cu aproximatie 0,2 mg, de la 0,1 la 1 g din proba preparata (pct. 5.1), in balonul de propilena (pct. 4.4). Cantitatea de proba cantarita trebuie sa aiba un continut de nitrogen de 10 mg. Se adauga 8,4 g de octahidrat de hidroxid de bariu (pct. 3.4) si 10 ml de apa. Se amesteca cu un mixer cu vortex (pct. 4.8) sau cu un agitator magnetic (pct. 4.7). Se lasa magnetul acoperit cu teflon, in amestec. Se spala peretii vasului cu 4 ml de apa. Se pune dopul cu surub si se inchide usor balonul. Se transfera intr-o autoclava (pct. 4.6) cu apa ce fierbe si se lasa la aburi pentru 30 - 60 de minute). Se inchide autoclava si se realizeaza autoclavare la 110 (+2) grade C pentru 20 de ore.
    Inaintea deschiderii autoclavei se reduce temperatura pana la 100 grade C. Pentru a evita cristalizarea Ba(OH)2 * 8H2O, se adauga la amestecul cald 30 ml de apa la temperatura camerei. Se scutura sau se agita usor. Se adauga 2,00 ml solutie standard intern concentrata (de a-metil-triptofan) (pct. 3.16). Se racesc vasele pe baie de apa timp de 15 minute. Se adauga apoi 5 ml de acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l (pct. 3.14). Se pastreaza vasul la baia de racire si se neutralizeaza cu HCl, c = 6 mol/l (pct. 3.11) in timp ce se agita si se ajusteaza pH-ul la 3,0 folosindu-se HCl, c = 1 mol/l (pct. 3.12). Se adauga suficient metanol pentru a se realiza o concentratie intre 10 si 30% de metanol in volumul final. Se transfera intr-un balon volumetric de volum corespunzator si se dilueaza cu apa pana la volumul definit, necesar pentru cromatografie (de exemplu 100 ml). Adaugarea de metanol nu trebuie sa cauzeze precipitate.
    Se filtreaza cativa ml din solutie printr-un filtru de membrana de 0,45 micrometri (pct. 4.5) inaintea injectarii pe coloana HPLC, se trece la etapa cromatografiei, in conformitate cu pct. 5.4. Se protejeaza solutia standard si hidrolizatele fata de lumina directa a soarelui. Daca nu este posibil sa se analizeze hidrolizatele in aceeasi zi, acestea pot fi depozitate la 5 grade C, pentru maximum 3 zile.
    5.4. Determinare prin HPLC
    Sunt oferite pentru instruire urmatoarele conditii de elutie isocratica; pot fi folosite alte situatii, cu conditia ca acestea sa ofere rezultate echivalente (a se vedea, de asemenea, observatiile de la pct. 9.1 si 9.2).
    Coloana de lichid cromatografie (pct. 4.2): 125 mm x 4 mm, C18, ambalaj de 3 micrometri sau echivalentul
    Temperatura coloanei: temperatura camerei
    Faza mobila (pct. 3.22): 3,00 g acid acetic apa (pct. 3.1) + 50,0 ml solutie (pct. 3.21) de 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (pct. 3.19) in metanol (pct. 3.8) (1 g/100 ml).
    Se ajusteaza pH-ul la 5,00, folosindu-se etanolamina (pct. 3.20).
    Se completeaza pana la 1.000 ml cu apa (pct. 3.1; de exemplu: 980 + 20 (v + v).
    Rata de curgere: 1 ml/min.
    Timpul total de functionare: aproximativ 34 min.
    Detectia la lungimea de unda: excitatie: 280 nm, emisie: 356 nm
    Volumul de injectie: 20 microlitri

    6. Calcularea rezultatelor

    A x B X C x D x E x MW = g triptofan / 100 g proba F x G x H x 10.000 x W

    A = zona peak-ului pentru standardul intern, solutie standard de calibrare (pct. 3.17)
    B = zona peak-ului triptofanului, extract (pct. 5.2) sau hidrolizat (pct. 3.3)
    C = volumul, in ml (2 ml), al solutiei de triptofan concentrat (pct. 3.15) adaugat solutiei de calibrare (pct. 3.17)
    D = concentratia, in micromol/ml (= 2,50), din solutia de triptofan concentrat (pct. 3.15) adaugata solutiei de calibrare (pct. 3.17)
    E = volumul, in ml, al solutiei concentrate standard intern (pct. 3.16), adaugata la extract (pct. 5.2) (= 5,00 ml) sau hidrolizat (pct. 5.3) (= 2,00 ml)
    F = zona peak-ului pentru standardul intern, extract (pct. 5.2) sau hidrolizat (pct. 5.3)
    G = zona peak-ului triptofanului, solutie standard de calibrare (pct. 3.17)
    H = volumul in ml (= 2,00) al solutiei standard intern concentrata (pct. 3.16), adaugata la solutia standard de calibrare (pct. 3.17)
    W = greutatea probei in g (corectata la greutatea originala, daca este uscata si/sau degresata)
    MW = greutatea moleculara a triptofanului (= 204,23)

    7. Repetabilitate
    Diferenta dintre rezultatele a doua determinari paralele, efectuate pe aceeasi proba, nu trebuie sa depaseasca 10% fata de cel mai mare rezultat.

    8. Rezultate ale unui studiu de colaborare
    A fost realizat un studiu de colaborare la nivelul comunitar (a patra intercomparatie) in cadrul caruia s-au analizat 3 probe, de catre 12 laboratoare, pentru a certifica metoda pentru hidroliza. Au fost mentionate contraprobe (5) din fiecare proba. Rezultatele sunt oferite de tabelul urmator:
___________________________________________________________________
                 Proba 1        Proba 2              Proba 3
                 Furaj pentru   Furaj pentru         Concentrat
                 porcine        porcine suplimentat  de furaj
                                cu L-triptofan       pentru porcine
___________________________________________________________________
L                 12               12                   12
___________________________________________________________________
N                 50               55                   50
___________________________________________________________________
medie [g/kg]       2,42             3,40                 4,22
___________________________________________________________________
Sr [g/kg]          0,05             0,05                 0,08
___________________________________________________________________
r [g/kg]           0,14             0,14                 0,22
___________________________________________________________________
CVr[%]             1,9              1,6                  1,9
___________________________________________________________________
SR [g/kg]          0,15             0,20                 0,09
___________________________________________________________________
R [g/kg]           0,42             0,56                 0,25
___________________________________________________________________
CVR[%]             6,3              6,0                  2,2
___________________________________________________________________
L:   numar de laboratoare
n:   numar de valori singulare
Sr:  deviatia standard a repetabilitatii
SR:  deviatia standard a reproductibilitatii
r:   repetabilitate
R:   reproductibilitate
CVr: coeficient de variatie al repetabilitatii
CVR: coeficient de variatie al reproductibilitatii
___________________________________________________________________

    A fost realizat un alt studiu de colaborare la nivelul comunitar (a treia intercomparatie) in cadrul caruia s-au analizat doua probe de catre 13 laboratoare, pentru a se certifica metoda de extractie pentru triptofanul liber. Au fost efectuate analize replicate (5) din fiecare proba. Rezultatele sunt oferite de tabelul urmator:
_________________________________________________________
                  Proba 4            Proba 5
                  Amestec de grau    Amestec de grau
                  si soia            si soia (= proba 4)
                                     cu triptofan adaugat
                                     (0,457 g/kg)
_________________________________________________________
L                     12                  12
_________________________________________________________
N                     55                  60
_________________________________________________________
medie [g/kg]           0,391               0,931
_________________________________________________________
Sr [g/kg]              0,005               0,012
_________________________________________________________
r [g/kg]               0,014               0,034
_________________________________________________________
CVr[%]                 1,34                1,34
_________________________________________________________
SR [g/kg]              0,018               0,048
_________________________________________________________
R [g/kg]               0,050               0,134
_________________________________________________________
CVR[%]                 4,71                5,11
_________________________________________________________
L:   numar de laboratoare
n:   numar de valori singulare
Sr:  deviatia standard a repetabilitatii
SR:  deviatia standard a reproductibilitatii
r:   repetabilitate
R:   reproductibilitate
CVr: coeficient de variatie al repetabilitatii
CVR: coeficient de variatie al reproductibilitatii
_________________________________________________________

    A fost realizat un alt studiu de colaborare la nivel comunitar, in cadrul caruia s-au analizat 4 probe de catre 7 laboratoare, cu scopul unei certificari a triptofanului prin hidroliza. Rezultatele sunt oferite mai jos. Analize replicate (5) au fost efectuate pe fiecare proba.
________________________________________________________________
            Proba 1      Proba 2          Proba 3      Proba 4
            Furaj        Hrana pentru     Hrana din    Pudra
            amestecat    peste, cu nivel  soia-fasole  de lapte
            pentru       scazut de        (CRM 119)    ecremat
            porcine      grasime                       (CRM 120)
            (CRM 117)    (CRM 118)
________________________________________________________________
L              7             7               7            7
________________________________________________________________
n             25            30              30           30
________________________________________________________________
medie
[g/kg]         2,064         8,801           6,882        5,236
________________________________________________________________
Sr [g/kg]      0,021         0,101           0,089        0,040
________________________________________________________________
r [g/kg]       0,059         0,283           0,249        0,112
________________________________________________________________
CVr[%]         1,04          1,15            1,30         0,76
________________________________________________________________
SR [g/kg]      0,031         0,413           0,283        0,221
________________________________________________________________
R [g/kg]       0,087         1,156           0,792        0,619
________________________________________________________________
CVR[%]         1,48          4,69            4,11         4,22
________________________________________________________________
L:   numar de laboratoare
n:   numar de valori singulare
Sr:  deviatia standard a repetabilitatii
SR:  deviatia standard a reproductibilitatii
r:   repetabilitate
R:   reproductibilitate
CVr: coeficient de variatie al repetabilitatii
CVR: coeficient de variatie al reproductibilitatii
________________________________________________________________

    9. Observatii
    9.1. Folosirea unor conditii de cromatografie speciale poate crea o mai buna separare intre tiptofan si a-metiltriptofan.
    Elutie isocratica urmata de spalarea gradientului de coloana lichid cromatografie cu: 125 mm x 4 mm, C18, ambalaje de 5 micrometri sau echivalent.
    Temperatura coloanei: 32 grade C
    Faza mobila: A: 0,01 mol/KH2PO4/metanol, 95 + 5(V + V) 1
                 B: Metanol
    Program gradient:  0 min. ....... 100% A    0% B
                      15 min. ....... 100% A    0% B
                      17 min. ........ 60% A   40% B
                      19 min. ........ 60% A   40% B
                      21 min. ....... 100% A    0% B
                      33 min. ....... 100% A    0% B
    Rata de culegere: 1,2 ml/min.
    Timpul total de separare: aproximativ 33 de minute
    9.2. Cromatografia variaza in concordanta cu tipul de HPLC si de materialul de impachetare a coloanei folosit. Sistemul ales trebuie sa fie capabil sa ofere o separare de baza intre tiptofan si standardul intern. Mai mult, este important ca produsele de degradare sa fie bine separate de triptofan si de standardul intern. Hidrolizatele fara standard intern trebuie testate pentru a se verifica linia de baza pentru impuritati sub standardul intern. Este important ca timpul de utilizare sa fie suficient de lung pentru elutia tuturor produselor de degradare, altfel pot interfera limite cu elutie tarzie cu utilizari cromatografice ulterioare. In domeniul functionarii sistemul de cromatografie trebuie sa ofere raspuns linear. Raspunsul linear trebuie masurat cu o concentratie constanta (normala) a standardului intern si a concentratiilor variate de triptofan. Este important si faptul ca marimea atat a peak-urilor triptofanului, cat si a peak-urilor standardelor interne este cuprinsa in domeniul linear al sistemului HPLC/fluorescenta. Daca peak-ul triptofanului si/sau al standardului intern este prea mic sau ridicat, analiza trebuie repetata cu o alta cantitate de proba si/sau cu un volum final schimbat.
    9.3. Hidroxid de bariu
    Cu timpul hidroxidul de bariu devine mai dificil de dizolvat.
    Aceasta duce la o solutie neclara pentru determinarea HPLC ce poate produce rezultate scazute pentru triptofan.