ORDIN Nr. 75
din 21 martie 2006
privind aprobarea Normei
sanitare veterinare ce stabileste criterii pentru zonare si supraveghere
oficiala ca urmare a suspiciunii sau confirmarii anemiei infectioase a
somonului
ACT EMIS DE:
AUTORITATEA SANITARA VETERINARA SI PENTRU SIGURANTA ALIMENTE
ACT PUBLICAT IN:
MONITORUL OFICIAL NR. 327 din 11 aprilie 2006
Văzând
Referatul de aprobare nr. 21.280 din 20 februarie 2006, întocmit de Direcţia de integrare europeană şi relaţii internaţionale din cadrul Autorităţiii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa
Alimentelor,
având în vedere prevederile art. 10 lit. b) din Ordonanţa Guvernului nr. 42/2004 privind
organizarea activităţii sanitar-veterinare
şi pentru siguranţa alimentelor, aprobată cu modificări şi completări prin Legea nr. 215/2004, cu modificările şi completările
ulterioare,
în temeiul art. 3 alin. (3) şi al art. 4 alin. (3) din Hotărârea Guvernului nr. 130/2006 privind organizarea şi funcţionarea Autorităţii
Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor şi a
unităţilor din subordinea
acesteia,
preşedintele Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor emite următorul ordin:
Art. 1. - Se aprobă Norma sanitară
veterinară ce stabileşte criterii pentru zonare şi supraveghere oficială ca urmare a suspiciunii sau confirmării anemiei infecţioase a somonului, prevăzută în anexa care
face parte integrantă din
prezentul ordin.
Art. 2. - Autoritatea Naţională Sanitară Veterinară şi pentru Siguranţa Alimentelor, institutele veterinare
centrale şi direcţiile sanitar-veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene
şi a municipiului Bucureşti vor duce la îndeplinire prevederile prezentului
ordin.
Art. 3. - La data intrării în vigoare a prezentului ordin se abrogă orice alte dispoziţii contrare.
Art. 4. - Prezentul ordin constituie transpunerea
Deciziei Comisiei 2003/466/CE ce stabileşte criterii pentru zonare şi supraveghere oficială ca urmare a suspiciunii sau confirmării anemiei infecţioase
a somonului, publicată în
Jurnalul Oficial al Comunităţilor
Europene (JOCE) nr. L 156 din 25 iunie 2003, p. 61.
Art. 5. - Prezentul ordin va fi publicat în Monitorul
Oficial al României, Partea I, şi va intra în vigoare la 15 zile de la publicare.
Preşedintele
Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor,
Ion Agafiţei
ANEXĂ
NORMA SANITARĂ VETERINARĂ
ce stabileşte criterii pentru zonare şi supraveghere oficială ca urmare a suspiciunii sau confirmării anemiei infecţioase a somonului
Articol unic. - Planurile de recoltare a probelor şi metodele de diagnostic pentru depistarea
şi confirmarea anemiei infecţioase a somonului, care va fi denumită în continuare AIS, precum şi criteriile de zonare şi supraveghere oficială ce urmează suspiciunii sau confirmării AIS sunt prevăzute
în anexa care face parte integrantă din prezenta normă
sanitară veterinară.
ANEXA la norma sanitară veterinară
PLANURI
de prelevare a probelor şi metode de diagnostic pentru
depistarea şi
confirmarea AIS şi criterii pentru zonare şi supraveghere oficială ce urmează suspiciunii sau confirmării AIS
Introducere şi definiţii
Prezenta anexă:
a) furnizează liniile directoare şi cerinţele minime
pentru planurile de prelevare a probelor şi metodele de diagnostic pentru depistarea şi confirmarea prezenţei AIS;
b) integrează prevederile şi
definiţiile stabilite de Norma
sanitară veterinară privind condiţiile de sănătate a animalelor, care reglementează punerea pe piaţă a animalelor şi a
produselor de acvacultura, aprobată prin Ordinul ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor nr.
494/2001, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 191 din 21
martie 2002, ce transpune Directiva Consiliului 91/67/CEE, şi de Norma sanitară veterinară cu privire la măsurile
minime pentru controlul anumitor boli ale peştilor, aprobată
prin Ordinul ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor nr. 241/2002, publicat în
Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 813 din 8 noiembrie 2002, ce
transpune Directiva Consiliului 93/53/CEE;
c) stabileşte prevederile având ca scop punerea unui diagnostic corect,
controlul şi supravegherea
AIS, în caz de suspiciune sau confirmare a AIS;
d) se adresează atât autorităţilor
responsabile pentru controlul AIS, cât şi personalului laboratorului ce efectuează testări cu privire
la această boală. Se bazează pe procedurile de prelevare a probelor, principiile şi aplicaţiile testelor de laborator şi evaluarea rezultatelor acestora, precum şi pe tehnicile detaliate de laborator. Cu toate acestea, atunci când
este adecvat, laboratoarele pot aplica modificări ale testelor descrise în prezenta anexă sau pot utiliza teste diferite, cu condiţia să se demonstreze
că au o sensibilitate şi specificitate echivalente sau
superioare. In plus, sunt stabilite criteriile pentru stabilirea zonării şi supravegherii oficiale ca urmare a suspicionării sau confirmării AIS.
Pentru scopul prezentei anexe, se vor aplica următoarele definiţii suplimentare:
a) zonă de captare a apei - întreaga zonă de captare, începând de la sursa cursului
de apă până la estuar, sau o parte a acestei zone,
începând de la sursa de apă
până la o barieră naturală ori artificială
care previne migrarea peştelui
de la această barieră;
b) zonă de coastă - o parte a coastei sau a apei mării ori a unui estuar, cu o delimitare
geografică precisă, ce constă într-un sistem hidrologic omogen sau într-o serie de asemenea
sisteme.
I. Criteriile pentru diagnosticarea AIS şi pentru stabilirea zonelor,
anumite măsuri
de control şi
supraveghere oficială
1.1. Principii generale pentru diagnosticul AIS
Motivele rezonabile pentru ca peştii să fie suspectaţi ca
fiind infectaţi cu virusul AIS
sunt enumerate la pct. 1.2. Statele membre ale Uniunii Europene trebuie să se asigure că în urma unei suspiciuni la o fermă cu peşti infectaţi cu virusul AIS se va efectua cât mai
curând posibil o anchetă oficială pentru a confirma sau a infirma prezenţa bolii prin inspecţie şi examinare clinică,
precum şi prin recoltarea şi selectarea probelor şi a metodelor de examinare la laborator, aşa cum sunt stabilite la pct. III şi IV. In scopul confirmării oficiale a prezenţei AIS trebuie să fie îndeplinit oricare dintre cele trei seturi de criterii
stabilite la pct. I.3:
1.2. Suspiciunea infecţiei cu AIS
1.2.1. Prezenţa AIS trebuie suspectată dacă se îndeplineşte cel puţin unul dintre următoarele
criterii:
a) prezenţa unor constatări
post-mortem compatibile cu prezenţa AIS, cu sau fără semne clinice de boală. Constatările post-mortem şi
semnele clinice de boală trebuie
să fie în conformitate cu cele
stabilite de ediţia curentă a Manualului Organizaţiei Internaţionale a Epizootiilor (O.I.E.) de diagnostic pentru bolile
animalelor acvatice;
b) izolarea şi identificarea virusului AIS în culturi celulare de la o singură probă prelevată de la
orice peşte din ferma descrisă la pct. III;
c) o probă rezonabilă a
prezenţei AIS în cel puţin două teste independente de laborator, cum ar fi: PCR-RT (pct. IV) şi testul IAF (pct. V);
d) transferul peştilor vii într-o exploataţie unde există motive
serioase de a suspecta prezenţa
AIS în momentul transferului peştilor;
e) acolo unde o investigaţie prezintă alte
elemente epidemiologice substanţiale care să conducă la AIS - ferme suspecte sau confirmate.
I.2.2. Suspiciunea de AIS poate fi exclusă dacă investigaţiile,
implicând cel puţin o inspecţie clinică pe lună pe o perioadă de 6 luni, nu mai evidenţiază semnificativ prezenţa AIS.
1.3. Confirmarea AIS
Prezenţa
AIS trebuie considerată ca şi confirmată dacă este
îndeplinit unul dintre criteriile de la lit. a), b) sau c):
a) semne clinice şi constatări
post-mortem compatibile cu AIS, în conformitate cu ediţia curentă a
Manualului O.I.E. de diagnostic pentru bolile animalelor acvatice, incluzând:
moartea, slăbirea sau
comportamentul anormal al peştelui,
semne de anemie sau dacă sunt
observate alte constatări
post-mortem şi schimbări patologice, iar virusul AIS este
detectat după una dintre următoarele metode sau mai multe:
(i) izolarea şi identificarea virusului AIS în cultură celulară de la cel
puţin o probă prelevată de la orice peşte
din ferma descrisă la pct.
III;
(ii) detectarea virusului AIS prin metodele PCR-RT
descrise la pct. IV;
(iii) detectarea virusului AIS în ţesuturi sau în preparate tisulare prin
intermediul anticorpilor specifici împotriva virusului AIS (de exemplu: testul
indirect cu anticorpi fluorescenţi sau amprentele renale descrise la pct. V);
b) izolarea şi identificarea virusului AIS în două probe de la unul sau mai mulţi peşti, din ferma
testată în diferite ocazii,
folosindu-se metodele descrise la pct. III;
c) izolarea şi identificarea virusului AIS din cel puţin o probă prelevată de la orice peşte din fermă,
folosindu-se metodele descrise la pct. III, cu confirmarea existenţei virusului AIS în preparate tisulare
provenite de la orice peşte
din fermă, folosindu-se fie
PCR-RT (pct. IV), fie testul IAF (pct. V).
1.4. Criterii pentru stabilirea şi revocarea zonelor pentru control şi supraveghere oficială ca urmare a suspiciunii şi confirmării AIS
I.4.1. In scopul stabilirii unui program de supraveghere
oficială bazat pe risc,
statele membre ale Uniunii Europene trebuie să stabilească
controale corespunzătoare şi zone de supraveghere în vecinătatea unei exploataţii a cărei infectare cu AIS este suspectată sau confirmată
oficial.
I.4.2. Zonele pentru control şi supraveghere oficială stabilite trebuie să fie definite pe baza unei analize de la caz la caz a riscului răspândirii ulterioare a bolii. In
conformitate cu situaţia
epizootica, zona de captare a apei sau zona de coastă:
(i) trebuie să fie definită ca
zonă de control; sau
(ii) se poate ca zonele de coastă şi zonele de captare a apei extinse să fie divizate în zonă de control şi zonă de supraveghere, dacă împiedicarea răspândirii AIS nu este compromisă.
In plus, supravegherea adiţională a zonelor
poate să fie, după cum este necesar, stabilită în afara zonei de captare a apei sau a
zonei de coastă.
I.4.3. Factorii principali de luat în considerare
pentru stabilirea zonelor de mai sus sunt cei care influenţează riscurile de răspândire
a bolii la peştii din ferme
sau la cei sălbatici, precum:
numărul, rata şi distribuţia mortalităţii peştilor din ferma suspectată sau în care s-a confirmat infectarea cu
virusul AIS; cauza mortalităţii
din ferma respectivă; distanţa până la fermele din vecinătate şi densitatea
acestora; fermele de contact; speciile prezente în fermă; managementul care se aplică în fermele afectate şi în cele învecinate; condiţiile hidrodinamice şi alţi factori semnificativi epidemiologie, identificaţi în cadrul investigaţiilor epizootice efectuate în conformitate
cu art. 5 alin. (2) şi art. 8
din Norma sanitară veterinară aprobată prin Ordinul ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor nr.
241/2002.
I.4.4 Pentru stabilirea zonelor pentru control şi supraveghere oficială se vor aplica următoarele criterii minime:
I.4.4.1. Autoritatea Naţională Sanitară Veterinară şi pentru Siguranţa Alimentelor trebuie să stabilească o zonă de control
în vecinătatea imediată a fermelor în care s-a confirmat prezenţa virusului AIS, după cum urmează:
- în zonele de coastă: zona inclusă
într-un cerc cu raza egală cu
cel puţin lungimea unei deplasări a mareei sau cu o lungime de cel puţin 5 km, cu centrul în ferma în care s-a
confirmat existenţa virusului
AIS, sau o zonă echivalentă determinată în conformitate cu datele hidrodinamice şi epidemiologice corespunzătoare; sau
- în zonele interioare: întreaga zonă de captare a apei din ferma în care s-a
confirmat infectarea cu virusul AIS; în zonele extinse de captare a apei
Autoritatea Naţională Sanitară Veterinară şi pentru Siguranţa Alimentelor poate să limiteze extinderea zonei la părţi ale zonei de
captare, cu condiţia de a nu
compromite împiedicarea răspândirii
AIS.
I.4.4.2. O zonă temporară de
control trebuie stabilită, în
cazul suspicionării prezenţei virusului AIS, pe baza aceloraşi criterii care au fost trasate pentru
zona de control.
I.4.4.3. O zonă de supraveghere trebuie stabilită, dacă este
necesar, de către Autoritatea
Naţională Sanitară Veterinară şi pentru Siguranţa Alimentelor în afara zonei de control în sectoare în care este
considerată suficientă o supraveghere mai puţin intensă şi trebuie să corespundă cu:
- în zonele de coastă: o suprafaţă care
în jurul zonei de control se suprapune zonei ce acoperă distanţa deplasării mareei sau o suprafaţă care înconjoară zona de control şi
este cuprinsă într-un cerc cu
raza de 10 km pornind din centrul zonei de control ori o zonă echivalentă, determinată în
conformitate cu datele hidrodinamice şi epidemiologice; sau
- în zonele interioare: dacă este necesar, cu o zonă extinsă, situată în afara zonei de control stabilite.
I.5. Vid sanitar şi suprimarea zonelor stabilite
I.5.1. Autoritatea competentă din România se va asigura că toate fermele din cadrul zonelor de control fac obiectul unei
perioade corespunzătoare de
vid sanitar după ce au fost
golite de peşte şi dezinfectate după cum este necesar.
Durata perioadei de vid sanitar în ferma în care s-a
confirmat infectarea cu AIS trebuie să fie de cel puţin 6
luni. Durata perioadei de vid sanitar pentru alte ferme aflate în zone de
control va fi determinată de
autoritatea competentă,
evaluându-se riscul fiecărui
caz.
Atunci când toate fermele din zona de control sunt
golite, se vor aplica cel puţin
6 săptămâni de vid sanitar sincronizat.
In plus, autoritatea competentă poate decide asupra instituirii vidului sanitar în fermele din
zonele de supraveghere stabilite.
I.5.2. Zonele de control stabilite nu pot fi suprimate
şi repopulate până când toate fermele situate în aceste zone
nu au fost golite de peşte,
dezinfectate după cum este
necesar şi supuse vidului
sanitar în conformitate cu pct. I.5.1. Când este efectuată repopularea zonelor, zonele de control
trebuie transformate în zone de supraveghere, aşa cum este stabilit la pct. I.4.4.3.
I.5.3. Zonele temporare de control stabilite nu pot fi
suprimate până când nu a fost
exclusă suspiciunea de AIS în
conformitate cu pct. I.2.2. In cazul confirmării AIS în conformitate cu pct. I.3, zona temporară de control va fi transformată în zonă de control.
I.5.4. Zonele de supraveghere stabilite nu pot fi
suprimate decât după 2 ani de
la suprimarea zonei de control.
I.6. Supravegherea oficială ca urmare a suspiciunii sau
confirmării AIS
I.6.1. Cu referire la art. 5 alin. (2) şi la art. 6 din Norma sanitară veterinară, aprobată prin
Ordinul ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor nr. 241/2002, ce transpune
Directiva 93/53/CEE, şi pentru
a stabili distribuţia şi evoluţia bolii ca urmare a suspiciunii sau confirmării AIS într-o fermă, un program oficial de supraveghere bazat
pe risc trebuie efectuat de autoritatea competentă ori de serviciile calificate de sănătate a peştilor în toate fermele situate în zona
stabilită, cu consultarea şi sub controlul autorităţii competente.
I.6.2. Pentru scopul aplicării unui astfel de program de supraveghere oficială, autoritatea competentă trebuie, dacă este necesar, printr-o inspecţie la faţa locului,
să identifice toate fermele
din zonele stabilite şi să facă un recensământ
oficial al tuturor speciilor, categoriilor şi numărului peştilor care sunt ţinuţi în ferme,
incluzând şi cifrele de
mortalitate.
I.6.3. In urma recensământului oficial iniţial, fermele din cadrul zonelor de control temporare stabilite, care
conţin somonul de Atlantic (Salmo
salar) sau orice altă
specie la care cea mai recentă
ediţie a Codului O.I.E. de sănătate a animalelor acvatice se referă ca fiind susceptibilă sau potenţial purtătoare de AIS, trebuie să raporteze autorităţii competente, la fiecare 14 zile, date
asupra mortalităţii.
Mortalitatea crescută trebuie
raportată zilnic şi pe cuşcă.
Autoritatea competentă trebuie să
investigheze orice creştere
semnificativă a mortalităţii într-o fermă.
Dacă
suspiciunea este confirmată,
toate fermele din zonele de control stabilite trebuie să raporteze săptămânal autorităţii competente asupra mortalităţii, în fiecare zi şi pe fiecare cuşcă.
Fermele care se află în zonele de supraveghere vor raporta rata mortalităţii autorităţii competente la fiecare 14 zile.
In plus, inspecţiile se vor efectua regulat timp de un an în zonele prestabilite şi cu frecvenţa precizate în tabelul nr. 1. Cu toate acestea, când condiţiile climatice fac ca aceste inspecţii să nu fie posibile o perioadă din an, Autoritatea Naţională Sanitară Veterinară şi pentru Siguranţa Alimentelor poate stabili în planul de
contingenţă altă frecvenţă pentru inspecţii.
Programul de supraveghere oficiala
- Tabelul nr. 1 -
|
Localizarea fermei
|
Numărul minim de
inspecţii într-un an
|
Numărul minim
de inspecţii
într-un an după ce zona a
fost suprimată
|
|
Zonă de control
|
12
|
|
|
Zonă de
supraveghere
|
6
|
6
|
|
Zonă temporară de control
|
6
|
|
Programul de supraveghere va fi continuat până când zona va fi suprimată.
I.6.4. Inspecţiile, precum şi
selecţia, colectarea,
prepararea şi expedierea
probelor trebuie efectuate potrivit pct. II.1, II.2, II.3 şi II.4. Examinarea probelor trebuie făcută în conformitate cu pct. III şi IV.
II. Inspecţia şi
prelevarea probelor
II.1. Inspecţia, selecţia şi
colectarea probelor la o fermă unde se suspectează prezenţa AIS
II.1.1. La inspecţiile obişnuite
efectuate în cadrul programului de supraveghere oficială descris la pct.
I.6 şi în fermele suspecte de
infectarea cu anemia infectioasă a somonului, toate echipamentele fermelor (cuşti, rezervoare sau lacuri artificiale) vor
fi inspectate pentru a se detecta prezenţa eventualelor cazuri de peşti morţi, slăbiţi sau care au un comportament anormal. Pe cât posibil, peştii morţi de curând (nedescompuşi), slăbiţi sau cu comportament anormal vor fi
examinaţi pentru a detecta
semnele clinice sau pentru a efectua constatarea post-mortem a prezenţei anemiei infecţioase a somonului, aşa cum este descrisă
în actuala ediţie a Manualului
O.I.E. pentru diagnosticul bolilor animalelor acvatice.
II.1.2. Dacă sunt observate semne clinice recente, compatibile cu cele ale
anemiei infecţioase a
somonului, sau un inspector ori un medic veterinar are un alt motiv să suspecteze faptul că peştele ar putea fi infectat, se va colecta un număr de cel puţin 10 peşti pentru
examenul de laborator. Pe cât posibil, probele se vor preleva din rândul
cazurilor recente de mortalitate şi al celor slăbite
sau cu un comportament anormal. Dacă nu sunt suficienţi
peşti care să prezinte semne clinice, atunci numărul de probe va fi completat cu peşti sănătoşi, selectaţi din cuşti,
rezervoare sau lacuri artificiale care prezintă cel mai mare nivel de mortalitate sau de peşti care arată semne clinice de boală.
II.1.3. Dacă se observă cazuri
recente de mortalitate, slăbire
sau de comportament anormal, însă semnele clinice, împreună cu constatările
post-mortem, nu sunt compatibile cu semnele anemiei infecţioase a somonului, recoltarea probelor nu
este obligatorie, deşi aceste
recoltări pot fi cerute de
inspectorul sau medicul veterinar pentru efectuarea diagnosticului diferenţiat.
II.1.4. Acolo unde peştii proveniţi din
ape naturale sunt suspectaţi
ca fiind infectaţi cu anemia
infectioasă a somonului,
Autoritatea Naţională Sanitară Veterinară şi pentru Siguranţa Alimentelor se va asigura că probele corespunzătoare
sunt prelevate şi examinate
prin metodele clinice şi de
laborator adecvate, după cum
este stabilit la pct. II -VI, pentru a exclude sau a confirma prezenţaanemiei infecţioase a somonului şi
pentru a aprecia dacă apariţia bolii prezintă o ameninţare
semnificativă pentru ferma
piscicolă.
II.2. Pregătirea probelor provenite de la peşti
II.2.1. Probele pentru examinarea histologică trebuie prelevate doar de la peşti care au fost ucişi de curând, care aveau semnele clinice
sau constatările post-mortem
compatibile cu prezenţa bolii.
Se vor preleva probe din orice leziune internă sau externă şi, în orice caz, probe de ficat, de
rinichi median, inimă şi splină vor fi prelevate de la fiecare peşte, folosindu-se un bisturiu, şi vor fi transferate într-o soluţie salină de
formol, tamponată cu o
concentraţie cuprinsă între 8 şi 10% (vol./vol.). Proporţia dintre fixator şi
ţesut trebuie să fie de cel puţin 20:1 pentru asigurarea unei conservări satisfăcătoare a ţesutului.
II.2.2. Ţesuturile pentru examinarea virusologică vor fi prelevate de la toţi peştii din eşantion. Probele vor fi recoltate în dublu
exemplar pentru reconfirmarea rezultatelor. Bucăţi de ficat, rinichi anterior, inimă şi splină vor fi prelevate de la peşti, folosindu-se un instrument steril, şi vor fi transferate într-un tub de
plastic conţinând 9 ml soluţie de transport, adică un mediu de
cultură celulară cu antibiotic. Este potrivită o combinaţie de 12,5 µg ml-1 fungizonă, 200 U.l. ml-1 polimixină B şi 200 µg ml-1
kanamicină, dar se pot folosi şi alte combinaţii a căror eficienţă a fost demonstrată. Ţesuturile prelevate de la cel mult 5 peşti pot fi colectate într-un singur tub conţinând soluţie de
transport şi reprezentate pe
un singur eşantion. Greutatea
unei probe de ţesut va fi de
1,0 ± 0,5 g.
II.2.3. Amprentele renale vor fi prelevate pentru
testul indirect cu anticorpi fluorescenţi doar de la peşti
care au fost ucişi de curând,
adică la cel mult două ore de la moarte. O bucată de rinichi median va fi prelevată de la peşte, folosindu-se instrumente sterile. Ţesutul va fi tamponat cu hârtie absorbantă pentru a îndepărta
sângele în exces, apoi se va presa în mod repetat pe o lamelă acoperită cu poli-L-lizină.
Amprentele individuale vor fi alăturate, dar nu se vor suprapune, pentru a da o continuitate câmpului
celular. Sângele şi lichidul
tisular nu reprezintă un
material relevant pentru acest test. Trebuie să se evite „scurgerea" amprentei renale pe hârtia absorbantă pentru că acest lucru poate produce coagularea sângelui, fapt ce ar produce o
mare cantitate de ser proteic pe lamela pentru testare. Amprentele vor fi
uscate prin expunere la aer, apoi vor fi păstrate reci şi
uscate, dacă nu sunt fixate
imediat. Fixarea trebuie să se
facă în termen de 72 de ore
din momentul amprentării.
Alternativ, amprentele pot fi congelate şi depozitate pentru maximum o lună la temperatura de -20°C înainte de fixare.
II.2.4. Peştii care prezintă
semne de anemie pot fi asomaţi
şi imediat li se vor recolta
probe de sânge heparinat pentru examenul hematologic, precum şi pentru măsurarea hematocritului.
II.2.5. Ţesuturile pentru analizele PCR-RT vor fi prelevate de la toţi peştii din eşantion.
Se va preleva de la peşte o
bucată din rinichiul
anterior sau median şi,
folosindu-se un instrument steril, se va transfera
într-un microtub care conţine
1 ml soluţie pentru
conservarea ARN a cărei
eficacitate e dovedită. Ţesuturile care provin de la cel mult 5 peşti pot fi colectate într-un singur tub cu
soluţie conservantă, reprezentând o singură probă. Greutatea unei singure probe de ţesut nu va avea mai mult de 0,5 g. Când peştele este prea mic pentru a se putea obţine o probă din
greutatea cerută, bucăţile de rinichi, inimă, splină, ficat sau cecumuri pilorice pot fi prelevate, în această ordine, pentru a obţine o probă de 0,5 g. II.3. Expedierea probelor prelevate de la peşte
II.3.1. Probele de sânge şi tuburile care conţin ţesuturi de la
peşte pentru examinarea
virusologică sau pentru
analizele PCR-RT vor fi plasate în containere izolate (de exemplu, cutii cu
perete gros de polistiren), cu o cantitate suficientă de gheaţă sau de
baterii de refrigerare pentru a asigura răcirea probelor pe timpul transportului către laborator. Se va evita congelarea, iar la momentul recepţiei trebuie să mai existe încă
gheaţă în cutia de transport a
recipientului sau una ori mai multe baterii de refrigerare trebuie să fie încă, parţial sau
complet, îngheţate. In
circumstanţe excepţionale, probele destinate analizelor
PCR-RT şi cele destinate
examinării virusologice pot fi
congelate şi transportate la
laborator la temperatura de -20°C sau mai scăzută.
II.3.2. Lamelele pentru testul indirect cu anticorpi
fluorescenţi trebuie să fie expediate în suporturi pentru lamele
împreună cu o cantitate
suficientă de substanţă desicatoare pentru a păstra amprentele uscate şi reci după cum se indică mai
sus.
II.3.3. Dacă ţesuturile peştelui sunt transportate într-o substanţă fixatoare pentru examenul histologic,
acestea trebuie să fie
expediate într-un tub etanş
plasat într-un recipient rezistent la şocuri, ca de exemplu în cutii de polistiren cu pereţii groşi.
II.3.4. In afara cazului când probele au fost
congelate, examinarea virusologică trebuie să înceapă cât mai curând posibil şi nu mai târziu de 72 de ore de la
colectarea probelor. Probele pentru analizele de confirmare vor fi stocate la
temperatura de -20°C sau mai puţin la sosirea la laborator.
II.3.5. Peştii întregi pot fi transportaţi la laborator dacă în timpul transportului sunt îndeplinite toate cerinţele de temperatură descrise la pct. II.3.1. Peştele întreg va fi învelit în hârtie absorbantă şi expediat în pungă
de plastic la temperatură scăzută, după cum s-a menţionat mai sus.
II.3.6. Peştele viu poate fi, de asemenea, expediat, dar numai sub
supravegherea unui serviciu oficial.
II.3.7. Pentru analizele PCR-RT ale ţesutului conservat în ARNIater, extractul
de ARN trebuie transportat într-un anumit timp în funcţie de temperatura la care este stocat. Aceste perioade sunt prezentate
mai jos:
-37°C o zi;
-25°C o săptămână;
-4°C o lună;
sub -20°C nedefinit.
II.3.8. Toate ambalările şi etichetările trebuie să fie executate în conformitate cu prezentele reglementări naţionale şi internaţionale de transport, după cum este adecvat.
II.4. Colectarea unui material de diagnostic
suplimentar
Cu acordul laboratorului de diagnostic pot fi recoltate
alte ţesuturi de la peşte şi pregătite pentru
examinare suplimentară.
III. Examinarea virusologică
III.1. Pregătirea probelor
III.1.1. Atunci când apar dificultăţi practice care fac imposibilă inocularea celulelor în 72 de ore de la
colectarea probelor de ţesuturi,
este acceptată o congelare a ţesuturilor la temperatura de -80°C cel
mult 28 de zile. Ţesutul
trebuie congelat şi decongelat
doar o singură dată înaintea examinării.
III.1.2. Fiecare probă (ţesuturi inundate
în soluţie de transport)
trebuie complet omogenizată,
folosindu-se un mixer, blender sau un mojar cu pistil, centrifugată la o turaţie de la 2.000 la 4.000 x g timp de 15 minute la o temperatură cuprinsă între 0°C şi 6°C,
iar supernatantul va fi filtrat (0,45 µm) şi incubat împreună
cu un volum egal de amestec diluant corespunzător de antiser contra serotipurilor indigene ale virusului necrozei
pancreatice infecţioase,
denumită în continuare NPI.
Titrul antiserului trebuie să fie de cel puţin
1:2.000 într-un test de neutralizare pe lamă de 50%. Amestecul va fi incubat timp de o oră la temperatura de 15°C. Acesta reprezintă inoculumul.
Tratarea tuturor inocula cu ser antivirus contra
NPI (un virus care într-o mare parte din Europa este prezent în 50% din probele
de la peşte) are ca scop
prevenirea apariţiei, pe
culturi celulare inoculate, a efectului citopatic, denumit în continuare ECP,
prin dezvoltarea virusului NPI în culturile celulare inoculate. Acest lucru
va reduce durata examinărilor
virusologice, precum şi numărul de cazuri în care apariţia ECP va trebui considerată ca indicatoare potenţială de virus AIS.
Atunci când probele provin de la unităţile de producţie care sunt considerate libere de NPI, tratamentul aplicat la inocula
serului antivirusului de NPI nu este necesar.
III.2. Inocularea culturilor celulare
III.2.1. Celulele de SHK-1 (80 pasaje sau mai puţin) ori celulele de TO vor fi cultivate
într-un mediu de L-15, care conţine 5% ser de fetus bovin, 2% (v/v) 200 mM de L-glutamină şi 0,08% (v/v) de 2-mercaptoetanol la 50 mM, pe lame de cultură cu 12 sau 24 de godeuri. Celelalte
tulpini celulare ale căror
eficacitate şi sensibilitate
sunt dovedite pentru izolarea virusului AIS pot fi folosite, luându-se în
considerare variaţiile şi abilitatea acestor linii de a se
reproduce în diferite tulpini celulare. Suspensia de organe tratată cu antiser trebuie inoculată într-o cultură celulară tânără aflată în faza de
creştere activă, pentru a da o diluţie finală de material tisular într-un mediu de cultură la 1:1.000. Pentru fiecare suspensie de
organe se vor adăuga 40 µl
inoculat într-un godeu ce conţine
2 ml de mediu de cultură.
Pentru a reduce riscul contaminării încrucişate
este recomandat să se
folosească lame separate de 12
sau 24 de godeuri pentru probele provenite de la diferite locaţii de ferme piscicole.
III.2.2. O lamă trebuie lăsată neinoculată pentru a servi drept martor negativ. O altă lamă va fi
inoculată cu un izolat de
referinţă al virusului AIS ca
martor pozitiv, după cum
urmează: se vor inocula 100 µl
de preparat al virusului AIS (titrat minim 107 TCID 50 ml"1)
în primul godeu şi se amestecă bine. Un volum din acest material va fi
transferat din primul godeu pe cel de-al doilea pentru a se obţine o diluţie de 1:10 bine amestecată. Această operaţie se va repeta pe toate plăcile pentru a se obţine 6 diluţii 1:10. Stocul (preparaţia mamă) de virus
AIS poate fi păstrat la
temperatura de -80°C pentru cel mult 2 ani, dar în momentul decongelării trebuie folosit în cel mult 3 zile. Notă: se va avea grijă să se prevină
contaminarea încrucişată a probelor cu materialul martorului
pozitiv. Pentru evitarea acestui risc, martorii pozitivi se vor aşeza separat şi se vor manipula separat de lamele de testat.
III.2.3. Probele trebuie incubate la temperatura de 14
± 2°C pentru cel mult 15 zile.
III.3. Examenul microscopic
Folosindu-se un microscop, se vor examina de două ori culturi celulare pentru decelarea
ECP, prima dată între a 5-a şi a 7-a zi şi apoi între a 12-a şi a 14-a zi după
inoculare. Dacă un amestec
prezintă ECP, se va iniţia imediat procedura de identificare a
virusului, după cum se arată la pct. III.6. Dacă nu se observă nici o urmă de ECP
în a 14-a zi, se va executa un test de hemabsorbţie menţionat la
pct. III.4.
III.4. Hemabsorbţia
Reproducerea virusului AIS în culturi celulare nu are întotdeauna
ca rezultat apariţia ECP. De
aceea, fiecare godeu va face obiectul testului hemabsorbţiei descris mai jos sau, alternativ,
fiecare godeu va face subiectul unui test I.F descris, menţionat la pct. III.6.1.
III.4.1. Mediul de cultură celulară va fi
prelevat din fiecare godeu, inclusiv martorii pozitivi şi negativi, şi fiecare prelevare va fi pusă într-un tub steril etichetat. Se vor adăuga în fiecare godeu 500 µl 0,2% (v/v) suspensie de globule roşii spălate din sânge de iepure sau cal ori o suspensie de 0,05% (v/v) de
globule roşii spălate din sânge de păstrăv-curcubeu sau de somon de Atlantic şi se lasă la
incubat la temperatura camerei timp de 45 de minute. Celulele roşii vor fi îndepărtate şi fiecare
godeu va fi spălat de câte două ori cu mediul L-15. Fiecare godeu va fi
examinat la microscop.
III.4.2. Prezenţa ciorchinelui de globule roşii aderând la suprafaţa celulelor de SHK-1 sau TO va indica prezenţa probabilă a infecţiei cu
ortomyxovirus. Dacă testul
hemabsorbţiei este pozitiv, se
va executa imediat un test de identificare cu virus, după cum este menţionat la pct. III.6.
III.5. Subcultivare sau reînsămânţare
III.5.1. Subcultivarea se va efectua între a 13-a şi a 15-a zi. Se vor adăuga 225 µl supernatant de cultură în godeurile care conţin celule proaspete de SHK-1 în faza activă de creştere, pe lame de 12 godeuri, apoi se lasă la incubat, la temperatura de 14 ± 2°C cel mult 18 zile.
Folosindu-se un microscop, culturile celulare se vor examina de două ori pentru ECP, între cea de-a 5-a şi cea de-a 7-a zi şi între cea de-a 14-a şi cea de-a 18-a zi după inoculare. Dacă vreun amestec prezintă ECP, imediat va fi iniţiată procedura de
identificare a virusului menţionată la pct. III.6. Dacă nu se observă prezenţa ECP între
cea de-a 14-a şi cea de-a 18-a
zi, se va executa un test de hemabsorbţie, după cum se
prevede la pct. III.4.
III.5.2. Dacă se produce un efect citotoxic în primele 7 zile de incubare,
subcultivarea se va executa în acest stadiu şi celulele trebuie incubate 14 - 18 zile şi subcultivate din nou cu încă o incubare de 14-18 zile. Dacă efectul citotoxic apare după 7 zile, subcultivarea se va mai executa o singură dată şi celulele vor
fi incubate pentru a se obţine
un total de 28-36 de zile de incubare de la prima inoculare.
III.5.3. Dacă apare contaminarea bacteriană în cultura primară,
testul trebuie reluat folosindu-se omogenatul de ţesut stocat la temperatura de - 80°C. Inaintea inoculării omogenatul de ţesut este centrifugat la 4.000 x g timp de
30 de minute la o temperatură
cuprinsă între 0 şi 6°C şi supernatantul este filtrat la 0,22 ym.
Dacă contaminarea
bacteriană apare în timpul
subcultivării, supernatantul
va fi filtrat la 0,22 ym, inoculat pe celule proaspete şi incubat încă 14-18 zile.
III.6. Testele de identificare a virusului
Dacă se
observă ECP în orice stadiu
sau dacă testul hemabsorbţiei este pozitiv, se va efectua
identificarea virusului. Metodele de identificare a virusului AIS disponibile
sunt: testul imunofluorescenţei
IF, menţionat la pct. III.6.1,
şi testul PCR-RT, menţionat la pct. IV. Dacă se consideră că pot fi prezente
alte virusuri se recomandă efectuarea
unor teste suplimentare pentru identificarea acestora. Dacă aceste teste nu permit identificarea cu
precizie a virusului în mai puţin de o săptămână, supernatantul trebuie expediat către un laborator naţional de referinţă
sau către un laborator de
referinţă al Uniunii Europene
specializat în bolile peştelui
pentru a se identifica imediat virusul.
III.6.1. Imunofluorescenţa (IF)
III.6.1.1. Celulele SHK-1 (80 pasaje sau mai puţin) sau celulele de TO vor fi cultivate
într-un mediu L-15 care conţine:
5% ser de fetus bovin, 2% (v/v) de L-glutamină la 200 mM şi 0,08%
(v/v) de 2-mercaptoetanol la 50 mM în 24 sau 96 godeuri, cu o densitate care să producă o confluenţă mai
mare de 50%. Pot fi, de asemenea, folosite alte linii celulare sau medii de creştere cu eficacitate dovedită. Se vor adăuga 225 µl de supernatant de cultură ce se presupune a fi infectată cu virus în fiecare din cele două godeuri, se amestecă şi se transferă 225 µl pe următoarele două
godeuri la o diluţie de 1:5.
Două godeuri suplimentare vor
fi lăsate neinoculate pentru a
servi drept martor. Probele de la fiecare fermă piscicolă vor fi
lucrate pe lame separate, la fel şi cele care servesc drept martori. Virusul se controlează folosindu-se un izolat de referinţă al virusului AIS.
III.6.1.2. Lamelele vor fi incubate la 14±2°C şi examinate microscopic în timp de cel
mult 7 zile. Dacă se observă ECP într-un stadiu incipient sau dacă acest lucru nu apare în timpul celor 7
zile, următoarea etapă va fi fixarea. Pentru aceasta, godeurile
vor fi spălate cu PBS şi fixate prin incubare cu acetonă 80% timp de 20 de minute la temperatura
camerei. Lamelele vor fi uscate la aer şi colorate imediat sau stocate la o temperatură cuprinsă între 0 şi 6°C
pentru maximum 24 de ore înainte de colorare.
III.6.1.3. Duplicatele godeurilor vor fi colorate cu
anticorpi monoclonali 3H6F8 de virusul AIS sau orice alt anticorp monoclonal
ale cărui eficacitate şi specificitate au fost dovedite, diluate
în PBS şi incubate la
temperatura de 37 ± 4°C timp de 30 de minute. Anticorpii monoclonali vor fi
îndepărtaţi şi lamelele vor fi spălate de trei ori cu Tween 20 0,05% în PBS. Conjugatul IgG marcat cu
FITC (izotiocianat de fluoresceină) antişoarece
diluat în PBS trebuie adăugat
în fiecare godeu şi incubat la
temperatura de 37 ± 4°C timp de 30 de minute. Notă: diluţiile de la loturi diferite de anticorpi
monoclonali şi conjugatul FITC
trebuie optimizate în fiecare laborator.
III.6.1.4. Godeurile trebuie examinate imediat,
folosindu-se un microscop inversat, echipat pentru examinarea fluorescentei cu
un filtru corespunzător pentru
stimularea FITC. Un test este considerat pozitiv dacă se observă celule
flourescente. Pentru ca un test să fie valid trebuie ca martorii pozitivi să dea un rezultat pozitiv, iar cei negativi rezultat negativ.
IV. Examinarea probelor prin PCR-RT
IV. 1. Această secţiune descrie
procedura cerută pentru
amplificarea PCR a unei părţi a segmentului 8 al genomului virusului
AIS care poate fi efectuată pe
ţesut de peşte sau în cultura de virus AIS.
IV. 1.1. Extracţia ARN
a) Se îndepărtează ARNIater de
pe fiecare probă. Se adaugă 1 ml de apă distilată tratată cu DEPC în fiecare tub, iar apoi toate
tuburile vor fi centrifugate la 13.000 rpm timp de 5 minute la o temperatură cuprinsă între 0 şi 6°C.
b) Se va îndepărta supernatantul de pe fiecare probă, apoi se vor adăuga
800 µl TRIzol (Invitrogen) sau un alt reactiv, care s-a dovedit a fi echivalent
sau mai eficient, pe fiecare probă şi într-un tub
conţinând material de control
corespunzător (400 µl de apă distilată sau omogenat de rinichi prelevat de la peştii indemni de organisme patogene). Dacă este necesar, ţesuturile
vor fi disociate prin pipetări
repetate. Tuburile vor fi incubate la temperatura camerei timp de 5 minute. Se
vor adăuga în fiecare tub câte
160 µl de cloroform, acestea vor fi foarte bine agitate timp de 3 minute, apoi
vor fi centrifugate la 13.000 rpm timp de 15 minute, la o temperatură cuprinsă între 0 şi 6°C.
c) Stratul apos superior va fi transferat într-un
microtub de 1,5 ml etichetat, conţinând 500 µl izopropanol, şi tuburile vor fi incubate timp de 10 minute la temperatura camerei,
apoi centrifugate la 6.500 rpm timp de 15 minute la o temperatură cuprinsă între 0 şi 6°C.
d) Supernatantul va fi îndepărtat şi se va adăuga 1 ml etanol 75% pe tableta de ARN.
Tuburile vor fi apoi centrifugate la 6.500 rpm timp de 15 minute, la o
temperatură cuprinsă între 0 şi 6°C.
e) Supernatantul se îndepărtează, iar
tuburile vor fi lăsate
deschise aproximativ 3 minute pentru a permite etanolului rezidual să se evapore. Se vor adăuga 15 µl de apă distilată tratată cu DEPC pentru a suspenda din nou granula
şi, dacă este necesar, se
supune unei scurte centrifugări.
f) Se va folosi un spectrofotometru pentru a se calcula
concentraţia de ARN, precum şi gradul de puritate al probelor. Densităţile optice se măsoară la 260 şi 290 nm.
g) ARN-ul care trebuie folosit imediat (în aceeaşi zi) poate fi totuşi stocat temporar la o temperatură cuprinsă între 0 şi 6°C. ARN
care nu este utilizat imediat va fi stocat la temperatura de -80°C.
IV.1.2. Transcripţia inversă (RT)
a) Vor fi diluate 2 µg de ARN în apă distilată tratată cu DEPC
într-un tub de 1,5 ml. Când concentraţia de ARN a unei probe este prea mare pentru a permite utilizarea a
2 µg în reacţia RT, se va
utiliza cantitatea maximă
posibilă de ARN. ARN diluat va
fi incubat la o temperatură cuprinsă între 55 şi 60°C timp de 10 minute.
b) Tuburile care conţin ARN vor fi plasate pe gheaţă şi se vor adăuga reactivi RT pentru a da concentraţia finală de 1 xtampon, 1 mM dNTPs, 100 ng hexamer aleatoriu, 20 U RNase
inhibitor şi 200 U MMLV-TR în
volum total de 20 µl.
c) Tuburile vor fi incubate la temperatura de 37°C timp
de o oră.
d) ADNc va fi stocat la o temperatură cuprinsă între 0 şi 6°C
atâta timp cât este necesar şi
va fi utilizat în PCR cât de curând este posibil.
IV.1.3. PCR
a) Se vor adăuga 5 µl de ADNc la 45 µl amestec PCR pentru a da concentraţia finală de 1 xtampon 1,5 mM MgCI2, 0,2 mM pentru fiecare dNTP, 25 pmol
pentru fiecare primer şi 1 U
de Taq polimerază. Primerii
sunt: ISA+(5'-GGC-TAT-CTA-CCA-TGA-ACG-AAT-C-3') (primerul sens) şi ISA-(5'-GCC-AAG-TGT-AAG-TAG-CAC-TCC-3')
(primerul contrasens). Controalele negative pentru extragerea RT şi PCR trebuie să fie realizate.
b) Tuburile vor fi plasate într-un termociclu programat
la temperatura de 94°C timp de 5 minute, urmând apoi 35 de cicluri la 94°C timp
de un minut, la 55°C timp de un minut, la 72°C timp de un minut, cu o incubaţie finală la 72°C timp de 5 minute.
c) Rezultatul PCR va fi evaluat în urma electroforezei,
folosindu-se un gel de agar 2% colorat cu bromură de etidium şi
incluzând semne paralele marcate de-a lungul probelor şi controlul negativ pentru etapele RT şi PCR. Un singur produs de PCR de 155 pb va fi considerat un
indicativ pentru prezenţa ARN
al virusului AIS. Probele care conţin un produs suplimentar de 310 pb vor fi, de asemenea, considerate
a conţine ARN al V virusului
AIS. Probele care produc produse multiple PCR, incluzând cel puţin unul de aproximativ 155 pb, pot conţine ARN al virusului AIS. Acestea pot fi
investigate în continuare, folosindu-se probele de ADN sau secvenţa nucleotidelor.
IV.1.4. Confirmarea prin PCR a virusului AIS izolat în
cultură tisulară
Dacă un
efect citopatic (ECP) complet a fost observat în cursul examinării virusologice a probelor de ţesut în celulele SHK-1, se vor îndepărta 400 uI de supernatant de pe godeu şi vor fi puse într-un tub steril de 1,5
ml. Se va extrage ARN din această probă, după cum s-a arătat la pct. III.1, şi se va efectua testul PCR-RT. Dacă sunt folosite culturi fără CPE complet, supernatantul
va fi îndepărtat, celulele vor
fi răzuite de pe suprafaţa godeului sau flaconului şi plasate într-un tub steril de 1,5 ml
pentru a se extrage ARN şi a
se efectua un test PCR-RT.
IV.1.5. Confirmarea produselor de PCR cu ajutorul
probelor ADN
a) Specificitatea unui produs PCR de 155 pb poate fi
evaluată prin probarea unei
oligonucleotide care hibridează într-o regiune a produsului PCR, excluzându-se. Produsele PCR vor
face obiectul electroforezei în gel de agar 1%, în paralel cu marcarea mărimii şi cu un control pozitiv şi unul negativ pentru etapele RT şi PCR.
b) ADN va fi supus reacţiei Southern-blot pe o membrană şi
oligonucleotidele marcate (5'-CGGGAGTTGATCAGACATGCACTGA AGGTG-3') vor fi
incubate cu membrană, după etapele corespunzătoare prehibridării.
c) Probele nefixate şi cele fixate nespecific vor fi spălate de pe membrană,
iar probele fixate vor fi vizualizate.
d) Probele fixate pe un fragment de 155 pb (şi 310 bp dacă este prezent) vor fi evidenţiate pentru specificitatea PCR şi indică faptul că ARN virusul AIS a fost prezent în probă.
IV.1.6. Secvenţierea nucleotidică
a produselor PCR Specificitatea produselor de PCR poate fi evaluată prin examinarea secvenţei nucleotidelor din produsul PCR de 155
pb.
a) Produsul PCR va fi curăţat de gel de agar sau de soluţie.
b) Fragmentul va fi secvenţiat, folosind aceiaşi primeri ca cei utilizaţi pentru reacţia
PCR sau primeri vectori, dacă fragmentul
a fost donat într-un vector înaintea secvenţierii.
c) Secvenţa nucleotidelor va fi comparată cu cea a segmentului 8 al virusului AIS, disponibilă în baza de date EMBL pentru secvenţe nucleotidice (la numerele de acces
Y10404, AJ012285, AJ242016).
d) Prezenţa secvenţei
corespunzătoare celei a
segmentului 8 al virusului AIS este o dovadă a faptului că proba
conţine ARN al virusului AIS.
V. Examinarea amprentelor renale prin testul IAF
V. 1. Următorul protocol a fost stabilit pentru examinarea amprentelor renale
prin testul IAF
V.2. Prepararea şi colorarea amprentelor
V.2.1. Lamelele vor fi fixate în acetonă sau în metanol/acetonă (1:1) timp de 3 minute şi apoi uscate în aer. Inainte de colorare
fiecare lamelă va fi examinată, iar zonele corespunzătoare ale fiecărei lamele vor fi încercuite cu ajutorul unui creion ImmEdge™ sau cu
unul similar acestuia şi lăsate să se usuce în aer. Lamelele vor fi apoi plasate într-o soluţie de blocare (lapte smântânit 6% în PBS
conţinând Tween 20 0,2%) şi incubate împreună cu o agitare uşoară timp de 30 de
minute la temperatura camerei. Fiecare lamelă va fi uscată şi plasată orizontal într-o cutie glisieră care conţine
hârtie umedă pentru a menţine o atmosferă umedă.
V.2.2. Fiecare amprentă va fi acoperită cu
o soluţie de anticorp
monoclonal 3H6F8 contra virusului AIS (sau orice alt anticorp cu eficacitate şi specificitate dovedite) şi cutia glisieră va fi închisă şi incubată cu agitare timp de 60 de minute la temperatura camerei. In mod
normal, anticorpul va fi diluat 1:10 şi 1:100 în lapte smântânit 1%, însă diluţia reală trebuie determinată pentru fiecare lot. Lamelele vor fi spălate de câte 3 ori timp de două minute în PBS conţinând 0,1% Tween 20. Fiecare amprentă va fi acoperită cu o soluţie conţinând conjugat de capră antişoarece colorat FITC, diluat 1:1.000 în lapte smântânit 1%, şi incubată într-o atmosferă umedă timp de 60 de
minute la temperatura camerei. Lamelele vor fi spălate de câte 3 ori timp de două minute în PBS conţinând
0,1% Tween 20. Fiecare lamelă
va fi acoperită cu o soluţie de Citifluortm [500 µl] Citifluortm
amestecat cu 1,5 ml de Tween 20 0,1% (v/v) în PBS] sau cu orice alt mediu de
fixare potrivit, timp de 10 minute. Lamelele vor fi spălate de 3 ori în PBS conţinând 0,1% Tween 20. Dacă este necesară o
contracoloraţie, fiecare
amprentă poate fi acoperită cu iodură de propidium (0,01 mg/ml) în PBS conţinând 0,1% Tween 20 şi incubată timp de
3 minute la temperatura camerei. Lamelele vor fi spălate de 3 ori câte două minute în PBS conţinând
0,1% Tween 20. Lamelele vor fi uscate şi fixate în Citifluortm sau în orice alt mediu de fixare potrivit. Lamelele
vor fi stocate în întuneric la temperatura de 4°C înainte de examinarea la
microscop.
V.3. Examinarea la microscop folosind fluorescenta
Fiecare lamelă va fi examinată la
un microscop adecvat pentru epifluorescenţă, folosindu-se un filtru potrivit care va excita FITC producând un
verde caracteristic, fluorescent. Toate câmpurile din zonele definite de
creionul ImmEdge™ vor fi examinate sub obiective x 10 şi x 20 şi zonele
suspecte (cele care prezintă
un verde fluorescent) vor fi în continuare examinate sub un obiectiv x 40 şi cu iluminare fluorescentă/fază pentru a se asigura că fluorescenta este bine localizată în celule. Coordonatele zonelor suspecte vor fi înregistrate pentru
o confirmare ulterioară a
naturii fluorescentei de către
un al doilea examinator. După
citirea primului examinator, lamelele care sunt pozitive sau cele suspecte vor
fi reexaminate de un al doilea examinator şi rezultatele confirmate.
V.4. Controlul
V.4.1. Trebuie efectuate 3 tipuri de controale pentru
fiecare lot de lamele colorate pentru TIAF:
- amprentele renale de la somonul de Atlantic
neinfectat (control negativ);
- culturile celulare SHK-1 neinfectate sau orice alte
culturi celulare sensibile (control negativ);
- culturile celulare SHK-1 afectate de virusul AIS sau
orice alte culturi celulare sensibile (control pozitiv).
V.4.2. Dacă este posibil, se recomandă ca o amprentă renală de la un somon de Atlantic infectat cu
virusul AIS să fie supusă unui control pozitiv suplimentar.
V.4.3. Dacă un rezultat pozitiv este obţinut în orice control negativ, testul este considerat invalid pentru
toate lamelele care compun acel lot. Dacă toate lamelele din lot, supuse unui control pozitiv, sunt negative,
testul este considerat invalid pentru toate lamelele care compun lotul
respectiv. In cazul nereuşitei
controlului unui lot de lamele, acesta va fi distrus şi se va efectua o retestare folosindu-se duplicatele de amprente.
V.5. Examinarea altor ţesuturi
Această
tehnică poate fi aplicată altor ţesuturi de peşte,
cum ar fi ficatul, splina şi
inima, cu condiţia ca o
cantitate corespunzătoare de
celule endoteliale, leucocite sau limfocite să poată fi depozitată pe lamelă. Procedura standard rămâne aceeaşi pentru
fiecare ţesut, deşi pentru unele ţesuturi este de preferat omiterea coloraţiei cu iodură de
propidium recurgând la iluminarea în faze pentru identificarea tipului de
celule prezente pe amprentă.
VI. Histologia
Secţiunile
incluse în parafină vor fi tăiate la 5 um şi colorate, folosindu-se hematoxilina şi eosină. Schimbările histologice asociate cu AIS sunt
descrise în ediţia curentă a „Manualului OIE de diagnostic al
bolilor animalelor acvatice".
VII. Acronime şi abrevieri
ADNc Acid deoxiribinucleic complementar
ECP Efect citopatic
DEPC Dietilpropocarbonat
dNTP Deoxinucleotidă trifosfat
IF Imunofluorescenţă
TIAF Testul indirect cu anticorpi
fluorescenţi
OIE Oficiul Internaţional de Epizootii
VNPI Virusul necrozei pancreatice infecţioase
PBS Tampon fosfat salin
ARN Acid ribonucleic
PCR-RT Reacţia lanţului
polimeric (transcripţia
reversibilă)
SHK-1 Celulele de rinichi anterior de somon
TCID50 Doza infectantă pentru 50% din culturile celulare