ORDIN   Nr. 475 din  5 decembrie 2001

pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind utilizarea metodei de identificare microscopica si estimare a constituentilor de origine animala in controlul oficial al furajelor

ACT EMIS DE:                MINISTERUL AGRICULTURII, ALIMENTATIEI SI PADURILOR

ACT PUBLICAT IN: MONITORUL OFICIAL  NR. 112 din 11 februarie 2002

    Ministrul agriculturii, alimentatiei si padurilor,
    avand in vedere prevederile art. 31 alin. 1 din Legea sanitara veterinara nr. 60/1974, republicata, cu modificarile si completarile ulterioare,
    in temeiul Hotararii Guvernului nr. 12/2001 privind organizarea si functionarea Ministerului Agriculturii, Alimentatiei si Padurilor, cu modificarile si completarile ulterioare,
    vazand Referatul de aprobare nr. 146.034 din 26 noiembrie 2001, intocmit de Agentia Nationala Sanitara Veterinara,
    emite urmatorul ordin:

    Art. 1
    Se aproba Norma sanitara veterinara privind utilizarea metodei de identificare microscopica si estimare a constituentilor de origine animala in controlul oficial al furajelor, prevazuta in anexa care face parte integranta din prezentul ordin.
    Art. 2
    Agentia Nationala Sanitara Veterinara, Institutul de igiena si sanatate publica veterinara si directiile sanitare veterinare judetene si a municipiului Bucuresti vor aduce la indeplinire prevederile prezentului ordin.
    Art. 3
    Agentia Nationala Sanitara Veterinara va controla modul de aducere la indeplinire a prevederilor prezentului ordin.
    Art. 4
    Prezentul ordin va fi publicat in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I, si va intra in vigoare in termen de 10 zile de la data publicarii acestuia.

             Ministrul agriculturii, alimentatiei si padurilor,
                                Ilie Sarbu

    ANEXA 1

                        NORMA SANITARA VETERINARA
privind utilizarea metodei de identificare microscopica si estimare a constituentilor de origine animala in controlul oficial al furajelor

    CAP. 1
    Prevederi generale

    1. Toate probele de furaje supuse controlului oficial si pentru care exista interdictia de a contine constituenti de origine animala vor fi controlate obligatoriu si prin examen microscopic.
    2. Fixarea liniilor directoare prevazute in cap. II, precum si respectarea procedurilor de examinare microscopica nu exclud folosirea si a altor metode de analiza, care vor fi validate stiintific si aprobate de autoritatea sanitara veterinara competenta, pentru identificarea si/sau estimarea constituentilor de origine animala.
    3. In cazul depistarii de probe cu rezultate pozitive in urma utilizarii metodei microscopice, probele respective vor fi analizate obligatoriu si prin alte metode mai performante (inclusiv identificarea speciei), in vederea clarificarii situatiei.
    4. Furajele in care au fost depistati constituenti de origine animala vor putea fi folosite in hrana altor specii la care nu exista interdictie pentru astfel de componente.
    5. Institutul de igiena si sanatate publica veterinara va lua masuri de instruire a personalului propriu, a celui din laboratoarele sanitare veterinare de stat judetene, in vederea implementarii acestor prevederi.
    6. Orice rezultat pozitiv aparut in urma folosirii acestei metode va fi anuntat imediat Institutului de igiena si sanatate publica veterinara si Agentiei Nationale Sanitare Veterinare.

    CAP. 2
    Indrumator pentru identificarea si estimarea microscopica a constituentilor de origine animala din furaje

    1. Obiect si domeniu de aplicare
    Acest ghid se va utiliza acolo unde detectarea constituentilor de origine animala (definiti ca produse de la procesarea carcaselor sau partilor acestora de la mamifere, pasari sau pesti) din furaje se efectueaza prin examen microscopic.
    In cazul in care se cere si o apreciere cantitativa a acestor constituenti, se vor urma instructiunile prevazute la pct. 7.
    2. Sensibilitate
    In functie de natura constituentilor (< 0,1%).
    3. Principiu
    O proba reprezentativa, luata in acord cu prevederile impuse de Ordinul ministrului agriculturii, alimentatiei si padurilor nr. 390 din 15 octombrie 2001, va fi folosita dupa pregatire pentru identificare. Constituentii de origine animala sunt identificati pe baza caracterelor microscopice tipice (de exemplu: fibre musculare, parti de oase sau cartilaje, fire de par, sange, coaja de ou, oase de peste etc.). Identificarea se va face atat din filtrat (pct. 6.1), cat si din sedimentul concentrat (pct. 6.2) al probei.
    4. Reactivi*):
    4.1. agenti de clarificare:
    4.1.1. cloral hidrat (solutie apoasa 60% v/v);
    4.1.2. ulei de parafina;
    4.2. agenti de concentrare:
    4.2.1. tetracloretan (densitate 1,62);
    4.3. agenti de colorare:
    4.3.1. reactiv Bradford;
    4.3.2. solutie iod/iodura de potasiu;
    4.3.3. reactiv Millon;
    4.3.4. reactiv pentru cistina (2 g acetat de plumb si 10 g NaOH/100 ml H2O).
    Reactivii listati pot fi inlocuiti cu reactivi care dau rezultate asemanatoare.
------------
    *) Reactivii listati sunt disponibili comercial daca nu exista o alta mentiune.

    5. Echipament si accesorii:
    5.1. balanta analitica (d = 0,001 g);
    5.2. dispozitiv de maruntire, macinare;
    5.3. site cu ochiuri de 0,1 - 2 mm;
    5.4. stereomicroscop cu magnificatie > 50';
    5.5. microscop compus (magnificatie > 400') cu lumina polarizata;
    5.6. sticlarie de laborator.
    6. Procedura
    In functie de natura materialului (daca este necesar, se marunteste), se iau cel putin 10 g de proba si se divid in doua parti, una de cel putin 5 g pentru partea filtrata (pct. 6.1) si una de cel putin 2 g pentru sedimentul concentrat (pct. 6.2). Colorarea cu agenti de colorare (pct. 6.3) este recomandata pentru identificare.
    6.1. Identificarea constituentilor de natura animala in filtrat
    O cantitate de minimum 5 g din proba este trecuta prin site (pct. 5.3) in cel putin doua fractii.
    Fractia (fractiile) > 0,5 mm (sau o parte reprezentativa din fractie) se intinde in strat subtire pe un suport adecvat si se cauta componentii de origine animala la stereomicroscopul (pct. 5.4) cu diferite puteri de marire.
    In stratul (straturile) < 0,5 mm se cauta componentii de origine animala la microscopul compus (pct. 5.5) cu obiective diferite.
    6.2. Identificarea constituentilor din sediment concentrat
    Se iau cel putin 2 g (cantarite cu o precizie de 0,001 g) din proba, se introduc intr-un flacon sau intr-o palnie de separare si se adauga 15 ml de tetracloretan (pct. 4.2.1). Dupa omogenizare se agita continutul de mai multe ori si apoi se lasa in repaus (cel putin 1' si nu mai mult de 2 - 3') pentru depunerea sedimentului.
    Se decanteaza supernatantul si sedimentul este uscat la etuva si cantarit repetat pana la masa constanta (0,001 g). Cantarirea este necesara numai in cazul in care se face o apreciere cantitativa. Sedimentul se examineaza in intregime sau in cota-parte pentru fragmente de oase, la stereomicroscop (pct. 5.4) si la microscop (pct. 5.5).
    6.3. Utilizarea agentilor de clarificare si de colorare
    Identificarea microscopica a constituentilor de origine animala se poate face prin utilizarea agentilor speciali de clarificare si colorare:
    - cloral hidrat (pct. 4.1.1) - prin incalzire usoara structura celulara poate fi mult mai clara datorita gelatinizarii granulelor de amidon si indepartarii particulelor nedorite;
    - ulei de parafina (pct. 4.1.2) - componentele oaselor pot fi identificate datorita faptului ca majoritatea porilor raman umpluti cu aer si apar ca spatii negre cu diametrul de aproximativ 5 - 15 micro m;
    - reactivul Bradford (pct. 4.3.1) - este utilizat pentru detectarea proteinelor (culoare specifica albastra). Se dilueaza cu apa 1:4;
    - solutia de iod/iodura de potasiu (pct. 4.3.2) - este utilizata pentru identificarea amidonului (culoare albastra-violeta) si a proteinelor (culoare galben-portocalie). Se dilueaza daca este necesar;
    - reactivul Millon (pct. 4.3.3) - prin incalzire usoara componentele osoase capata o culoare roz;
    - reactivul pentru cistina (pct. 4.3.4) - prin incalzire usoara constituentii care contin cistina (par, fanere etc.) capata o culoare neagra-maronie.
    7. Calcul si evaluare
    In cazul in care estimarea cantitativa este necesara, se va proceda conform acestui punct.
    Calculul poate fi facut doar daca constituentii contin fragmente de oase. Fragmentele de oase de la animale terestre homeoterme (mamifere si pasari) pot fi deosebite de oasele de peste prin examen microscopic, pe baza vizualizarii lacunelor tipice. Proportia de constituenti de origine animala se poate calcula tinand seama de:
    - proportia estimata (masa, in %) de fragmente osoase din sediment; si
    - proportia (masa, in %) de oase in constituentii de origine animala.
    Estimarea se face pe baza a cel putin 3 (daca este posibil) pana la 5 campuri pentru un strat. In nutreturile combinate, de regula, sedimentul nu contine numai fragmente de oase, ci si alte componente cu greutate specifica mare, de exemplu: minerale, nisip, fragmente vegetale lignificate.
    7.1. Calculul procentual al fragmentelor de oase:

                           S x c
    Fragmente de oase % = -------
    (animale terestre)       W

                          S x d
    Fragmente de oase  = -------,
    si solzi % (peste)      W

    in care:
    S = masa sedimentului (mg); c = factor de corectie (%) pentru estimarea procentului de oase animale in sediment; d = factor de corectie (%) pentru estimarea procentului de oase de peste si solzi in sediment; W = masa probei prelucrate pentru sedimentare (mg).
    7.2. Estimarea valorii pentru constituenti de origine animala
    Proportia de oase in produsele animale este variabila. In cazul fainii de oase procentul este de 50 - 60%, iar in cazul fainii de carne, de 20 - 30%; la faina de peste procentul de oase si solzi este variabil in functie de specie, in general de 10 - 20% .
    Daca se cunoaste specia de la care provine produsul, se poate calcula continutul estimat.
    Continutul estimat de constituenti de la animale terestre (%) =

     S x c
    ------- x 100
     W x f

    Continutul estimat de constituenti de peste (%) =

     S x d
    ------- x 100,
     W x f

    in care:
    S = masa sedimentului (mg); c = factor de corectie (%) pentru estimarea procentului de oase animale in sediment; d = factor de corectie (%) pentru estimarea procentului de oase de peste si solzi in sediment; f = factorul de corectie pentru proportia de oase din constituentii de origine animala din proba; W = masa probei prelucrate pentru sedimentare (mg).
    8. Exprimarea rezultatelor
    Pot exista urmatoarele situatii:
    8.1. la capacitatea de identificare la microscop nu exista constituenti de origine animala (asa cum sunt definiti la pct. 1) in proba analizata;
    8.2. la capacitatea de identificare la microscop exista constituenti de origine animala*) in proba analizata.
    In acest caz raportul examinarii poate fi specificat astfel:
    8.2.1. la capacitatea de identificare la microscop exista cantitati mici de constituenti de origine animala*) in proba analizata;
------------
    *) Tipul constituentilor identificati, de exemplu oase (peste sau animale), constituenti din carne etc., trebuie sa fie indicat.

    8.2.2. in functie de experienta analistului:
    - exista constituenti de origine animala. Continutul de fragmente de oase (peste/animale terestre);
    - in cazul fragmentelor de oase de la animale terestre, eventual specificat de la pasari sau mamifere (vezi pct. 9.3), este estimat un ordin de marire de ......%, egal cu .......% constituenti animali, cand se calculeaza in baza a .......% oase in constituenti animali, utilizandu-se factorul de corectie f; sau
    - au fost gasiti constituenti de origine animala in cantitati masurabile.
    Pentru situatiile prevazute la pct. 8.2, 8.2.1 si 8.2.2, cand oasele animalelor terestre au fost identificate, raportul trebuie sa contina date suplimentare. Posibilitatea ca urmatorii constituenti sa fie derivati de la mamifere nu poate fi exclusa.
    Aceasta clauza nu este necesara daca fragmentele de oase de la animale terestre au fost identificate ca apartinand pasarilor sau mamiferelor (vezi pct. 9.3).
    9. Recomandari
    9.1. Se recomanda ca in cazul constituentilor voluminosi si in cantitate mare sedimentul obtinut la filtrare sa fie impartit in doua fractii (de exemplu, utilizarea unei site cu ochiuri de 320 micro m). Fractiunea cu constituenti voluminosi poate fi examinata ca preparat cu ulei de parafina, iar fractiunea cu particule fine trebuie examinata la microscop.
    9.2. Sedimentul concentrat (pct. 6.2), daca este necesar, poate fi divizat mai departe utilizandu se un agent de concentrare cu densitate mai mare.
    9.3. In functie de experienta analistului identificarea originii poate fi facuta utilizandu se un preparat specific histologic prin care poate fi facuta aceasta identificare.