ORDIN
Nr. 245 din 26 martie 2005
pentru aprobarea Metodologiei de evaluare a riscului substantelor periculoase
din listele I si II si al substantelor prioritare/prioritar periculoase in
mediul acvatic prin modelare matematica si a Metodologiei de evaluare a
impactului substantelor periculoase din listele I si II si al substantelor
prioritare/prioritar periculoase asupra mediului acvatic prin teste
ecotoxicologice - alge verzi, dafnia, pesti
ACT EMIS DE: MINISTERUL MEDIULUI SI GOSPODARIRII APELOR
ACT PUBLICAT IN: MONITORUL OFICIAL NR. 565 din 1 iulie 2005
In temeiul art. 6 alin. (6) din anexa la Hotararea Guvernului nr. 118/2002
privind aprobarea Programului de actiune pentru reducerea poluarii mediului acvatic
si a apelor subterane, cauzata de evacuarea unor substante periculoase si in
temeiul Hotararii Guvernului nr. 408/2004 privind organizarea si functionarea
Ministerului Mediului si Gospodaririi Apelor, cu modificarile si completarile
ulterioare,
ministrul mediului si gospodaririi apelor emite urmatorul ordin:
Art. 1
(1) Se aproba Metodologia de evaluare a riscului substantelor periculoase
din listele I si II si al substantelor prioritare/prioritar periculoase in
mediul acvatic prin modelare matematica, prevazuta in anexa nr. I*).
(2) Anexele nr. 1 - 4 fac parte integranta din metodologia prevazuta la
alin. (1).
Art. 2
(1) Metodologia prevazuta la art. 1 are ca scop evaluarea riscului pentru
biotopul si biocenoza mediului acvatic, pe baza prognozarii nivelului de
dispersie si acumulare a substantelor periculoase din listele I si II si a
substantelor prioritare/prioritar periculoase provenite de la evacuarile
acestor substante din surse punctiforme.
(2) Alternativ se poate utiliza modelul PC QUASAR pentru modelarea
matematica a evacuarilor de substante periculoase din listele I si II si a
substantelor prioritare/prioritar periculoase in resursa de apa receptoare, din
surse punctiforme.
Art. 3
Se aproba Metodologia de evaluare a impactului substantelor periculoase din
listele I si II si al substantelor prioritare/prioritar periculoase asupra
mediului acvatic prin teste ecotoxicologice - alge verzi, dafnia, pesti,
prevazuta in anexa nr. II*).
------------
*) Anexele nr. I si II sunt reproduse in facsimil.
Art. 4
(1) Metodologia prevazuta la art. 3 are ca scop stabilirea efectului toxic
al evacuarilor de ape uzate din surse punctiforme, cu continut de substante
periculoase din listele I si II si de substante prioritare/prioritar
periculoase, asupra sistemelor biologice acvatice din mediul acvatic, in
conformitate cu prevederile art. 6 alin. (6) din anexa la Hotararea Guvernului
nr. 118/2002 privind aprobarea Programului de actiune pentru reducerea poluarii
mediului acvatic si a apelor subterane, cauzata de evacuarea unor substante
periculoase.
(2) In cazul stabilirii efectului toxic acut, metodologia prevazuta la art.
3 se poate aplica numai pentru unul dintre cele 3 sisteme biologice acvatice
prevazute.
(3) In cazul stabilirii efectului toxic cronic se va aplica in mod
obligatoriu metodologia prevazuta la pct. D din anexa nr. II.
Art. 5
(1) Administratia Nationala "Apele Romane" va impune in
autorizatia de gospodarire a apelor, emisa evacuatorilor de substante
periculoase din listele I si II si de substante prioritare/prioritar
periculoase, valori limita de evacuare si obiective de calitate pentru apele
afectate de poluarea cu aceste substante sau expuse unei astfel de poluari, pe
baza aplicarii metodologiilor prevazute la art. 1 si 3.
(2) Metodologiile prevazute la art. 1 si 3 se vor aplica si pentru
stabilirea valorilor limita de evacuare si a obiectivelor de calitate pentru
substantele periculoase relevante stabilite pentru fiecare bazin hidrografic,
in conformitate cu Ordinul ministrului agriculturii, padurilor, apelor si
mediului nr. 44/2004 pentru aprobarea Regulamentului privind realizarea
monitoringului calitatii apelor pentru substante prioritare/prioritar
periculoase.
Art. 6
Metodologia prevazuta la art. 3 va fi aplicata de catre laboratoare
acreditate in domeniu, la solicitarea evacuatorilor de substante
prioritare/prioritar periculoase din surse punctiforme, ca parte a prevederilor
art. 5 alin. (1).
Art. 7
Directia de coordonare, reglementare, gestionarea, protectia ecologica a
apelor si districte internationale din cadrul Ministerului Mediului si
Gospodaririi Apelor va duce la indeplinire prevederile prezentului ordin.
Art. 8
Prezentul ordin intra in vigoare la 30 de zile de la data publicarii in
Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I.
Ministrul mediului si gospodaririi apelor,
Sulfina Barbu
ANEXA 1
METODOLOGIE
de evaluare a riscului substantelor periculoase din listele I si II si al
substantelor prioritare/prioritar periculoase in mediul acvatic prin modelare
matematica
Art. 1
Evaluarea riscului in cazul dispersiei substantelor periculoase din lista I
si II si a substantelor prioritare/prioritar periculoase ce provin din evacuari
continue ale activitatii antropice se face prin:
a) analiza propriu-zisa a prezentei acumularii acestora in verigile
biotopului (apa, sediment) si ale biocenozei (pesti, alge, crustacee), activitate
care necesita efort logistic, financiar, de validare si reprezentativitate a
datelor;
b) estimarea prin modelare matematica, in functie de proprietatile
substantei si parametrii fizico-chimici de moment ai apei, a cantitatilor
acumulate in biotop si biocenoza si particularizata prin factori de corectie
stabiliti in functie de veriga de mediu vizata la care abaterea estimarii se
stabileste prin analize propriu-zise paralele, efectuate in laborator la
fiecare 5 ani;
c) definitiile si notiunile utilizate in prezenta metodologie sunt
prevazute in anexa nr. 1.
Art. 2
Caracteristicile modelului matematic de nivel I:
- contine model matematic de nivel I a transferului substantelor
periculoase si prioritare in verigile ecosistemului acvatic, exprimat in
unitatile de masura prevazute in anexa nr. 2;
- contine model matematic de "fugacitate";
- utilizeaza proprietatile fizico-chimice, toxicologice si termodinamice -
coeficienti de partitie multi-matrice ale substantei periculoase sau prioritare,
prevazute in anexa nr. 3;
- utilizeaza o matrice de mediu;
- genereaza ecuatii care se valideaza utilizand: greutatea moleculara,
solubilitatea in apa, presiunea de evaporare, coeficientul de partitie
apa-octanol a substantei prioritare vizate, formula de fugacitate;
- calculeaza distributia de echilibru pentru substanta chimica cu etapele:
1. definirea mediului
2. determinarea proprietatilor fizico-chimice
3. calculul valorilor Z
4. determinarea cantitatii de substanta chimica
5. calculul fugacitatii, si, de aici, calculul concentratiilor si
cantitatilor.
Art. 3
Situatii de modelare matematica pentru mediu se utilizeaza pe 3 tipuri de
sisteme:
a) Sistem inchis, ecuatii de stare stabila - o cantitate data si constanta
in timp de substanta chimica se distribuie intre diferitele componente ale unui
sistem inchis; cantitatea totala de substanta chimica este egala cu suma
cantitatilor din fiecare componenta, fiecare din aceste cantitati fiind
produsul dintre o concentratie si un volum, pe baza ecuatiei de echilibru masic
si relatiilor la echilibru; sistemul este inchis pentru ca nu permite nici o
intrare si nici o iesire de substanta chimica.
Cantitatea totala = suma cantitatilor din fiecare componenta
M = 2 = VA x CA + VW x CW + VS x CS = 100CA + 50CW + 3CS
unde: A - aer, W - apa, S - sol
Relatiile dintre CA, CW si CS se exprima prin ecuatii de echilibru dintre
componente:
CA / CW = 0,5 si CS / CW = 100
2 = 100(0,5CW) + 50CW + 3(100 CW) = 400CW
CW = 2 / 400 = 0,005 mol/mc
De unde:
CA = 0,5CW = 0,0025 mol/mc
CS = 100CW = 0,5 mol/mc
Cantitatile din fiecare componenta (in moli) sunt produsele dintre C x V
dupa cum urmeaza:
mW = VW x CW = 0,250 mol (12,5%)
mA = VA x CA = 0,250 mol (12,5%)
mS = VS x CS = 1,500 mol (75%)
b) Sistem deschis, ecuatii de stare stabila - in ecuatia de echilibru masic
se introduce si curgerea substantei chimice in/din sistem si posibilitatea de
reactie in conditii de timp constante; fluxul masic total de intrare este egal
cu fluxul masic total de iesire si sunt exprimate in moli sau grame pe unitatea
de timp; unitatea de baza masica este mol/h sau g/h unde substanta chimica
intra intr-o reactie de ordinul intai de tipul:
V x C x K = mol/h,
unde: - V este volumul de apa,
C este concentratia substantei chimice din apa iazului la echilibru,
K este o constanta de ordin 10^-3 h^-1,
c) Ecuatii in regim variabil - conditiile de regim variabil dau ecuatii
diferentiale in timp. Cea mai simpla metoda de stabilire a ecuatiei este:
Fluxul total de intrare (admisie) - Fluxul total de iesire = d
(Continut)/dt
unde:
Coeficientii de intrare si iesire - mol/timp (mol/h);
Dt - cresterea in timp
H - unitatea de timp din termenii de intrare si de iesire.
Art. 4
Transportul si stationarea substantelor prioritare/prioritar/periculoase in
mediu:
a) Transport difuz - coeficientul de transport difuz (sau
"fluxul") este produsul departarii de echilibru si cantitatea
cinetica; acest produs devine zero cand componentele ating echilibrul.
In exemplul aer-apa, echilibrul apare cand calculul raportului
concentratiei apa-aer respecta formula de echilibru precizata si tine cont de
difuzie; se utilizeaza cantitatea totala de substanta chimica.
Procese de transport difuz al substantelor chimice sunt:
Volatilizarea substantelor chimice din sol sau apa in aer;
Absorbtia sau adsorbtia substantelor chimice de catre sedimente din apa;
Preluarea difuza a substantelor chimice din apa de catre pesti.
b) Transport nedifuz - produsul dintre volumul componentei transferat in
unitatea de timp si de concentratie, exprimat in mol/h sau g/h, care depinde de
viteza de eliminare din componenta de apa si nu este influentat de difuzie, sub
forma:
- depunerile de substante chimice din aer in apa sau pe sol antrenate de
praf, ploaie sau zapada;
- depunerea si resuspensia particulelor de substante chimice pe sedimente;
- ingestia si excretia substantelor chimice de catre biota.
c) Stationare in mediu - timpul de retentie in lacuri, reprezentat de
raportul intre timpul de retinere si timpul reactiei
C = C0 exp (-Gt / V) = C0 exp (-t / tF)
unde: V - volum lac (mc)
G - viteza de intrare si iesire (mc/h)
tF - timpul de retinere al fluxului (h); este inversul unei constante kF
care are unitati de h^-1
C0 - concentratia substantei chimice (mol/mc)
La o substanta chimica cu o viteza de reactie kRh^-1:
C = C0 exp - [(kF + kR)t] = C0 exp (-kTt)
este dominanta viteza mai mare.
Timpii caracteristici tF si tR (adica 1/kF si 1/kR) se combina reciproc si
dau timpul total tT:
1 / tF + 1 / tR = 1 / tT
unde:
- tR este persistenta reactiei;
- timpii caracteristici ca tR si tF
Art. 5
Compartimentele evaluative de mediu pentru model matematic de nivel I sunt
cele patru compartimente de baza ale mediului - aer, apa, sedimente sau sol si
biocenoza - ale caror caracteristici principale sunt prezentate in anexa 4 la
prezenta metodologie.
Art. 6
Stabilirea coeficientilor de partitie pentru sistemele aer-apa,
octanol-apa, lipide-apa, grasimi-apa, hexan-apa, carbon organic-apa, minerale -
apa, carbon activ - apa se aplica in cazul:
1. doua componente nemiscibile - se masoara experimental adaugand un solut
si masurand concentratia acestuia in fiecare din cele doua componente C1 si C2.
Valorile sunt liniare si deci:
C1 / C2 - K12
K12 - panta
2. doua componente miscibile:
a) cu apa - variatia liniara depinde de solubilitate, care nu are limita
pentru substantele miscibile cu apa;
b) cu aerul - solubilitatea in aer este data de presiunea de vapori a
substantei pure, care poate fi convertita in solubilitate prin impartirea cu RT
(R - constanta gazelor si T - temperatura). Intrucat C = n / V si PV = nRT,
avem:
C (mol/mc) = P(Pa) / R (= 8,314 Pa mc/mol K) x T(K).
Coeficient de partitie aer-apa - KAW - din ecuatia se estimeaza:
KAW = CA^S / CW^S = P^S / RTCW^S
S - simbolul pentru saturatie,
P^S - presiunea de vapori;
CW^S - solubilitatea in apa (mol/mc)
Solubilitatea C^S (mol/mc) = Solubilitatea (g/mc) / Masa moleculara
(g/mol).
c) cu octanolul: (KOW) - cu variatie de la 0,1 la 10^7;
d) cu carbonul organic (KOC) - tendinta substantelor organice hidrofobe de
a se adsoarbi pe carbonul organic prezent in sol si in sedimentele de fund,
caracterizand capacitatea de sorbtie a sedimentelor:
KOC = 0,41 KOW
Raportul dintre concentratia regasita in sol si apa (KP) este:
KP = CS / CW = (mg/kg) / (mg/l) = L/kg
KP depinde liniar de continutul de carbon organic y(g/g), aproape de
origine:
KP = y KOC
KOC - coeficientul de partitie carbon organic-apa.
e) cu lipidele (KLW) - corelatia intre sorbtia substantelor hidrofobe in
organisme vii si lipidele acestora (exprimate prin coeficientul de partitie
octanol-apa).
In cazul unui continut cunoscut de lipide al organismului viu, ecuatia de
corelatie este liniara:
KFW - 0,048 KOW la un continut de 5% lipide
f) cu componente dispersate ale fluidului: concentratiile masurate la o
substanta sunt o suma a concentratiei dizolvate si sorbite si trebuie sa se
cunoasca care este fractia continuta de fiecare componenta, astfel:
M = VA x CA + VB x CB = VT x CT
A - componenta continua
B - componenta dispersata
V - volumul componentei dispersate (un factor de 10^5 sau mai mic din
volumul componentei continue)
VA si VB - volumele celor 2 componente (mc)
VA >> VB
CA si CB - concentratiile de echilibru (mol/mc)
KAB = CB / CA
M - cantitatea totala de solut
CT - concentratia totala
Daca: VT aproximativ egal VA:
CB = KAB x CA
M = CA x (VA + VB x KAB) = CT x VA
Rezulta:
CA = CT / (1 + KAB x VB / VA) = CT / (1 + KAB x XB)
XB - este volumul fractiei de componenta B, adica VB / VA.
Fractia dizolvata este: CA / CT = 1 / (1 + KAB x XB)
Fractia sorbita este: (1 - CA / CT) = KAB x XB / (1 + KAB x XB).
KAB x XB - produsul dintre coeficientul de partitie adimensional si volumul
fractiei componentei disperse sorbita; la valoare 1 - in fiecare componenta se
afla jumatate din cantitatea de solut; la valoare mai mica decat 1, majoritatea
cantitatii de solut este dizolvata; la valoare mai mare decat 1 solutul este in
adsorbit).
La o serie de componente de volume V1, V2, V3 si V4, cu coeficientii de
partitie K21, K31, K41 si o cantitate cunoscuta M de substanta acest mediu:
M - egal cu suma termenilor produs - concentratie - volum:
M = C1 x V1 + C2 x V2 + C3 x V3 + C4 x V4 =
= C1 x V1 + (K21 x C1) V2 + (K31 x C1) V3 + (K41 x C1) V4 =
= C1 x (V1 + K21 x V2 + K31 x V3 + K41 x V4)
deci C1 = M / (V1 + K21 x V2 + K31 x V3 + K41 x V4)
unde C2 = K21 x C1 etc. si cantitatea m1 = C1 x V1 etc.
Art. 7
(1) Corelatia concentratiei cu fugacitatea (Z) depinde de:
- natura solutului;
- natura mediului sau compartimentului de mediu;
- temperatura;
- presiune;
- concentratie - neglijabil la concentratii scazute.
(2) Fugacitatea se calculeaza conform procedurilor prevazute in anexa nr.
6.
Art. 8
Calculul distributiei de echilibru pentru substanta chimica este relativ
simplu. Etapele ce trebuiesc urmate sunt urmatoarele:
1. definirea mediului
2. determinarea proprietatilor fizico-chimice
3. calculul valorilor Z
4. determinarea cantitatii de substanta chimica
5. calculul fugacitatii, si, de aici, calculul concentratiilor si
cantitatilor.
ANEXA 1
la metodologie
Notiuni si definitii utilizate in cazul modelului matematic de nivel I
Advectie - transportul unei substante chimice dintr-o regiune prin curgere
masiva.
Debit de intrare - (debitul de curgere a apei G - mc/h) x (concentratia C -
g/mc) = GC g/h
Viteza reactiei - (volum V - mc) x (constanta K - h^-1) x (concentratia C -
mol/mc) = Vk x C mol/h
Fugacitatea - tendinta de trecere a unei substante chimice dintr-o
componenta in alta atunci cand acestea sunt in contact, identica cu notiunea de
presiune partiala de la gazele ideale; este legata logaritmic de potentialul
chimic si variaza cu concentratia. La presiuni partiale scazute in conditii
ideale fugacitatea este egala cu presiunea partiala.
Relatie intre fugacitate si concentratia substantei chimice in fiecare
compartiment de mediu este aproape liniara:
C = Zf
Z - constanta de proportionalitate (capacitate de fugacitate) - mol/mc Pa
Mediul inconjurator - numarul de compartimente din jur care sunt in contact
unele cu altele: atmosfera, solul, un lac, sedimentele de pe fundul unui lac,
sedimentele in suspensie dintr-un lac, biota din apa si sol, substantele
chimice care pot migra intre ele (aerul si apa) precum si substantele chimice
care nu sunt in contact direct unele cu altele si migratia este imposibila
(aerul si sedimentele de pe fundul unei ape); unele compartimente sunt
accesibile substantelor chimice migratoare intr-un timp scurt (apele de
suprafata), dar alte compartimente sunt accesibile in ritm lent (apele din
lacurile adanci si oceane) sau deloc (solul profund sau roca).
Componente in stare de echilibru (apele iazurilor putin adanci) - omogene,
cu variatii interne de concentratie si temperatura neglijabile si fara
schimbari in timp.
Componentele in stare de ne-echilibru (solurile si sedimentele de fund) -
eterogene, cu concentratii ce difera de la o adancime la alta si presupune o
omogenitate posibila; o componenta care nu este eterogena poate fi considerata
omogena intr-una sau doua din cele trei dimensiuni. (exemplu: lacurile sunt in
echilibru pe orizontala dar nu pe verticala, un rau lat si de mica adancime
este in echilibru pe verticala nu si pe orizontala, in directiile curgerii
transversale si descendente).
Componente in regim stationar - nu se schimba nimic in timp; derivatele de
timp sunt zero.
Echilibrul si regimul stationar nu sunt sinonime; se pot aplica pe rand
fiecare, ambele sau nici unul.
Stare stabila si instabila - daca conditiile si proprietatile compartimentului
se schimba putin in timp, atunci compartimentul este "in stare
stabila" si caracterizarea se face independent de timp sau de "stare
instabila".
Cantitate - cantitatea de substanta chimica produsa, utilizata, obtinuta ca
produs intermediar sau transportata ce ajunge in mediul acvatic in mod direct
sau indirect prin intermediul altor activitati intermediare.
Presiunea de evaporare - presiunea maxima pe care o poate exercita
substanta chimica pura in atmosfera.
Alte efecte secundare: capacitatea de a influenta chimia atmosferica,
alterarea pH-ului, mirosul, culoarea, capacitatea de spumare;
Coeficientul de partitie - raportul dintre concentratiile aceleiasi
substante chimice in doua componente diferite; depinde de solubilitatea substantei
chimice in apa;
Coeficientul de partitie aer - apa - raportul dintre solubilitatea in aer
si solubilitatea in apa este coeficientul de partitie aer-apa; la un coeficient
de partitie apa-aer ce depaseste 0,01 substantele sunt considerate
"volatile";
Coeficientul de distributie - raportul concentratiilor totale ale tuturor
speciilor;
Suspensii solide - varietate de materiale ce contin materii minerale de tip
argila sau silice naturala, materie organica moarta sau descompusa de tip
humin, acid humic si acizi fulvici, materie organica in compozitii variabile
care provin de la materialul prezent in vegetatie, cu varietate de structuri
chimice de tip alcani, cicloalcani, grupari aromatice, acizi fenolici si
carboxilici; cu proprietati acide, cu solubilitate in solutii alcaline, in care
sunt prezenti in forma de ioni fenol sau carboxilat, dar pot precipita in
conditii acide.
Ecotoxicologia - studiaza actiunea elementelor si substantelor toxice din
mediul inconjurator asupra sistemelor biologice, in scopul prevenirii migrarii
substantelor toxice in organismele vii din ecosistem si diminuarii efectelor
nocive ale acestora la nivelul diferitelor lanturi trofice, actiuni cu rol
esential in protejarea mediului ambiant si a organismului uman.
Sistemul ecologic elementar/Ecosistemul - unitatea organizatorica
elementara a ecosferei - rezultat al integrarii biocenozei cu biotopul -
caracterizata printr-o anumita stabilitate, capabila de exercitarea celor trei
functii, respectiv fluxul de energie, circuitul materiei, functia de
autoreglare;
Sistemul ecologic acvatic/Ecosistemul acvatic - ecosistemul acoperit
permanent de apa.
Tipuri de ecosisteme acvatice: rau, lac, balta, mare etc.
Biocenoza (componente biologice) - comunitate unitara si complexa de
plante, animale, microorganisme;
Sistem biologic acvatic: organism acvatic
Biotop - locul ocupat de o biocenoza, cuprinzand compartimentele unitatii
hidrogeomorfologice - apa/sediment si componentele fizico-chimice ce creeaza
conditiile de viata pentru diferite sisteme biologice.
Structura trofica a unui ecosistem acvatic - gruparea populatiilor dupa
regimul trofic. Este compusa din module trofodinamice:
a) Producatorii primari - macrofite, alge - care convertesc energia
radianta solara in energia legaturilor chimice ale substantelor organice pe
care le sintetizeaza din substanta anorganica prezenta in biotop cu ajutorul
clorofilei; producatorii primari reprezinta primul nivel trofic;
b) Consumatorii - toate animalele din biocenoza, inclusiv pestii; in
functie de hrana consumata sunt de mai multe ordine (I, II, III, IV), traiesc
pe seama producatorilor primari deoarece nu pot sintetiza substanta organica
din substanta minerala;
c) Descompunatorii sau reducatorii - bacterii saprofite care degradeaza
substantele organice provenite din cadavre, excretii sau alte deseuri, in
substanta minerala reutilizabila de catre plantele verzi.
Lantul trofic - calea prin care se produce transferul de substanta si
energie in orice ecosistem.
Monitoringul ecotoxicologic - urmareste evolutia poluantilor toxici in
ecosistemele acvatice precum si efectele lor asupra sistemelor biologice.
Poluantii toxici - substante care produc moartea, mutatii genetice,
functionari defectuoase fiziologice sau deformari fizice ale organismelor vii
sau ale urmasilor acestora si, de asemenea, care pot deveni nocive, dupa
concentrarea lor in lantul trofic sau in combinatii cu alte substante; prezenta
poluantilor toxici in ecosistem afecteaza productivitatea biologica,
biodiversitatea, respectiv integralitatea acestuia.
Productivitatea biologica - procesul de generare a biomasei in ecosistem
exprimat printr-o rata sau viteza de fixare a energiei in cadrul unei structuri
exprimata in totalitatea compartimentelor care participa la desfasurarea
fluxului de energie, precum si de conexiunile dintre ele; mecanismele
productivitatii biologice sunt definite ca totalitatea proceselor biotice si
abiotice specifice fluxului de energie, circuitului elementelor si autoreglarii
sistemelor ecologice.
Productivitatea biologica primara - viteza de acumulare a biomasei de catre
sistemele biologice autotrofe, respectiv plante verzi, microorganisme
fotosintetizante si chemosintetizante, ca urmare a procesului de fotosinteza si
chemosinteza.
Productivitatea biologica secundara - viteza de acumulare de biomasa ca
urmare a activitatii metabolice a sistemelor biologice heterotrofe, respectiv
animale, ciuperci.
Testele toxicologice - instrumente prin care se pot identifica si estima
efectele provocate de substante periculoase si prioritare/prioritar periculoase
asupra organismelor acvatice; in functie de durata si concentratie se clasifica
in:
a) Testele de toxicitate acuta - dau informatii, pe termen scurt, de 4, 8,
12, 24, 48, 72, 96 h, despre toxicitatea substantelor, in caz de poluare
accidentala sau evacuare continua, asupra componentelor biologice acvatice
afectate si contribuie la luarea unor masuri imediate de protectie;
Intoxicarile acute - apar cand concentratia substantei toxice este mare si
simptomele apar dupa un timp de contact scurt;
b) Testele subcronice - evidentiaza efectele substantelor asupra
componentelor biologice acvatice pe un timp mai lung, respectiv 7 si 10 zile;
testele subcronice impreuna cu cele acute se folosesc:
1. in cazul utilizarii pe termen limitat a unor substante cu un
comportament necunoscut pentru mediu sau in amestecuri necunoscute cu
substantele deja existente in ape, amestecuri care pot conduce la efecte mai
severe datorita sinergismului sau potentarii toxicitatii;
2. la fundamentarea limitei maxime admisibile pentru o substanta;
3. la prognozarea efectului global al substantei asupra unui corp de apa in
cazul evacuarilor de ape uzate industriale cu un continut complex de substante.
c) Testele cronice - evidentiaza efectul ecotoxicologic de lunga durata,
intre 30 de zile si 150 de zile, al substantei urmarite si aflata in
concentratii subletale, asupra componentei biologice in functie de
caracteristicile substantei investigate; efectele ecotoxicologice de lunga
durata au ca rezultat restructurarea biocenozei in sensul simplificarii ei prin
reducerea numarului de specii si afectarea mostenirii genetice, precum si
acumularea de catre organismele acvatice si transferul ulterior la om, cu
consecinte negative asupra populatiei umane.
Intoxicarile cronice - apar cand concentratia substantei toxice este redusa
si simptomele devin aparente dupa un timp de contact indelungat; efectele unei
astfel de intoxicari prezinta un caracter insidios, putand fi evidentiat prin
tehnici speciale; in unele cazuri efectele pot fi observate si la urmasi.
CL50 - concentratia medie letala - concentratia substantei din apa, care
omoara 50% din organismele test intr-o perioada scurta, de expunere continua.
EC50 - concentratia efectiva care omoara 50% din indivizi; folosita in
special in cazul dafniilor.
NOEC - nici un efect al concentratiei
NC - concentratia neglijabila
CMA / LMA - concentratie maxim permisibila / Limita maxima admisibila -
acea concentratie a substantei care, ajunsa in mediu, nu afecteaza
biodiversitatea si echilibrul ecologic.
Persistenta - proprietate specifica fiecarei substante, influentata de
lantul de procese fizice, chimice si biologice si exprimata prin timpul de
injumatatire a substantei.
Bioacumularea - procesul de concentrare de catre componente biologice care
traiesc in medii poluate cu o gama larga de compusi organici si minerali de
tipul:
a) substante hidrofobe - se distribuie in mediile organice si mai ales in
tesuturile grase, au o solubilitate mica in si un mare coeficient de partitie
apa/octanol;
b) substante hidrofile - se distribuie in apa sau in medii si solutii
apoase, au solubilitate mare.
Biodegradare - proces de descompunere a unor substante, obiecte sau corpuri
organice sub actiunea organismelor vii si in special a microorganismelor din
grupul bacteriilor si al ciupercilor microscopice.
ANEXA 2
la metodologie
Unitati de masura utilizate de modelul matematic de nivel I
Lungime - metru - m;
Suprafata - metrul patrat - mp; dozarile pesticidelor in soluri se exprima
in kg/ha.
Volum - metrul cub - mc (litrul - echivalent a 0,001 mc este de asemenea
folosit datorita usurintei in analiza);
Greutatea - kilogramul - kg.; pentru greutatile mai mari se foloseste tona
metrica echivalenta;
Cantitatea de materie - molul - mol;
Masa (sau greutatea) moleculara - g/mol;
Forta - N - forta care imprima unui corp de 1 kg o acceleratie de 1 m pe
secunda, egal cu 10^5 dine si este aproximativ forta gravitationala care
actioneaza asupra unui corp de 102 g la suprafata Pamantului.
Presiunea - Pa. O atmosfera (atm.) este 101 325 Pa sau 101.325 Kpa. Un torr
sau 1 mm. mercur (mm. Hg) este 133 Pa.
Energia - J. Un Joule, care este 1 N x m sau Pa x mc, este tot o cantitate
mica.
Temperatura - K. Kelvinul este unitatea preferata, desi temperaturile de
mediu sunt exprimate in mod normal in grade Celsius, grade C, 0 grade C fiind
273.16 K.
Frecventa - Hz.
Constanta gazelor - constanta care deriva din legea gazelor ideale - 8,314
J/mol x K sau Pa x mc/mol x K.
Logaritmi - unitatea logaritmica preferata este logaritmul natural in baza
"e" sau 2.7183, desemnat la ln. Logaritmii in baza 10 se utilizeaza
pentru anumite cantitati, cum ar fi coeficientul de partitie octanol/apa si
pentru reprezentarea grafica. Functia exponentiala sau naturala antilogaritmica
a lui x se scrie fie e^x, fie exp (x). Logaritmul cu baza 10 a unei cantitati
este logaritmul natural impartit la 2,303 sau ln 10.
Prefixe - Prefixele utilizate sunt prezentate in Tabelul nr. 1.
Tabel nr. 1
_____________________________________________________
| Factor | Prefix | Factor | Prefix |
|____________|_____________|____________|_____________|
| 10^1 | Deka da | 10^-1 | Deci d |
| 10^2 | Hecto h | 10^-2 | Centi c |
| 10^3 | Kilo k | 10^-3 | Mili m |
| 10^6 | Mega M | 10^-6 | Micro micro |
| 10^9 | Giga G | 10^-9 | Nano n |
| 10^12 | Tera T | 10^-12 | Pico p |
| 10^15 | Peta P | 10^-15 | Femto f |
| 10^18 | Exa E | 10^-18 | Atto a |
|____________|_____________|____________|_____________|
ANEXA 3
la metodologie
Proprietati chimice cheie ale unor substante prioritare/prioritar
periculoase (la 25 grade C)
______________________________________________________________________________
| Substanta |Masa |Punct |Punct |Solubilitate|Presiune | Log
|
| |moleculara|de |de | |de vapori | KOW
|
| | |topire|fierbere| | |
|
| | (g/mol) |(grade|(grade | (g/mc) | (Pa) |
|
| | | C) | C) | | |
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| n-hexan | 86.2 | -95 | 68 | 9.5 | 20200 | 4.11
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Ciclohexan | 84.2 | 6.55 | 80.7 | 55 | 12700 | 3.44
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| n-octan | 114.2 | -56.2| 125.7 | 0.66 | 1880 | 5.18
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Benzen | 78.1 | 5.53 | 80 | 1780 | 12700 | 2.13
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Toluen | 92.1 | -95 | 111 | 515 | 3800 | 2.69
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| p-xilen | 106.2 | 13.2 | 138 | 185 | 1170 | 3.15
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Naftalina | 128.2 | 80.2 | 218 | 31.7 | 10.4 | 3.35
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Bifenil | 154.2 | 71 | 277.5 | 7.48 | 1.2 | 4.03
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Antracen | 178.2 | 216.2| 340 | 0.041 | 0.0008 | 4.63
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Fenantren | 178.2 | 101 | 339 | 1.29 | 0.0161 | 4.57
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Piren | 202.3 | 156 | 360 | 0.135 | 0.0006 | 5.22
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Benzo(a)piren | 252.3 | 175 | | 0.0038 | 0.0000007| 6.04
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Cloroform | 119.4 | -63.5| 81 | 8200 | 23080 | 1.97
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Tricloretilena | 131.4 | -73 | 87 | 1100 | 9870 | 2.29
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| 1,1,1-tricloretan | 133.4 | -32 | 113 | 730 | 12800 | 2.47
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Triclorfluormetan | 137.4 | -111 | 23.8 | 1100 | 91600 | 2.53
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Clorbenzen | 112.6 | -46.5| 132 | 472 | 1580 | 2.84
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| 1,4-diclorbenzen | 147.0 | 53.1 | 174 | 83.1 | 90.2 | 3.40
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| 1,2,4-triclorbenzen| 181.5 | 17 | 213.5 | 34.6 | 60.6 | 4.00
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Hexaclorbenzen | 284.8 | 230 | 322 | 0.005 | 0.0023 | 5.50
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| 2-clorbifenil | 188.7 | 34 | 374 | 1.3 | 2.04 | 4.54
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| 2,2',4,4'- | 291.9 | 83 | | 0.068 | 0.02 | 5.90
|
| tetraclorbifenil | | | | | |
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| 2,2',4,4',6,6'- | 360.9 | 114 | | 0.0007 | 0.0016 | 7.00
|
| hexaclorbifenil | | | | | |
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| 2,3,7,8-TCDD | 322.0 | 305 | | 0.0000193 | 0.0000001| 6.80
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| 2,3,7,8-TCDF | 306.0 | 227 | | 0.000419 | 0.000002 | 6.10
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| DDT | 354.5 | 108.5| | 0.0031 | 0.00002 | 6.19
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Mirex | 545.6 | 485 | | 0.00007 | 0.0001 | 6.89
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Fenol | 94.1 | 40.9 | 181.75 | 82000 | 70.6 | 1.46
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Pentaclorfenol | 266.4 | 190 | 310 | 14 | 0.0147 | 5.01
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| p-cresol | 108.1 | 34.8 | 201.9 | 16800 | 14.67 | 1.95
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Dietilhexilftalat | 390.6 | -50 | 386.9 | 0.4 | 0.0000267| 5.30
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| Clorpirifos | 350.6 | 42 | | 0.4 | 0.0015 | 5.11
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
| 2,4-D (acid) | 221.0 | 138 | 215 | 890 | 0.000056 | 2.81
|
|____________________|__________|______|________|____________|__________|______|
ANEXA 4
la metodologie
Compartimentele de mediu si structura modelarii matematice nivel I
______________________________________________________________________________
| Compartimentul | Volumul | Densitatea| Compozitia
|
| | (mc) | (kg/mc) |
|
|____________________________________|_______________|___________|_____________|
| Aer | 6 x 10^9 | 1,2 | -
|
| | (1 x 10^9)* | |
|
|____________________________________|_______________|___________|_____________|
| Apa | 7 x 10^6 | 1000 | -
|
| | (1 x 10^9)* | |
|
|____________________________________|_______________|___________|_____________|
| Sol (50% substanta solida, | 4,5 x 10^4 | 1500 | 2% carbon
|
| 20% aer, 30% apa) | (13,5 x 10^4)*| | organic
|
|____________________________________|_______________|___________|_____________|
| Sediment (37% substanta solida) | 2,1 x 10^4 | 1300 | 5% carbon
|
| | (3000)* | | organic
|
|____________________________________|_______________|___________|_____________|
| Suspensii solide | 35 | 1500 | 16,7%
carbon|
| | (5)* | | organic
|
|____________________________________|_______________|___________|_____________|
| Aerosoli | 0,12 | 1500 | 30
microg/mc|
| | (0,02)* | | sau
|
| | | | 2 x 10^-11
|
| | | | volum
fragm.|
|____________________________________|_______________|___________|_____________|
| Biota acvatica | 7 | 1000 | 5% lipide
|
| | (1)* | | |
|____________________________________|_______________|___________|_____________|
| Biota terestra | 3000 | 1000 | 1% lipide
|
| | (9000)* | |
|
|____________________________________|_______________|___________|_____________|
| Suprafete (mp) | | |
|
|____________________________________|_______________|___________|_____________|
| Aer-apa | 7 x 10^5 x (1 x 10^5)
|
|____________________________________|_________________________________________|
| Apa-sediment | 7 x 10^5 x (1 x 10^5)
|
|____________________________________|_________________________________________|
| Sol-aer | 3 x 10^5 x (9 x 10^5)
|
|____________________________________|_________________________________________|
| | Procese
|
|____________________________________|_________________________________________|
| Ploi | 0,8 m/an sau 800000 mc/an
|
| | 560000 mc (80000 mc)* in apa
|
| | 240000 mc (720000 mc)* in sol
|
|____________________________________|_________________________________________|
| Viteze de depunere aerosol (total) | |
|____________________________________|_________________________________________|
| Depuneri uscate | 216 x 10^-6 mc/h sau 1,89 mc/an
|
|____________________________________|_________________________________________|
| Depuneri umede | 365 x 10^-6 mc/h sau 3,2 mc/an
|
|____________________________________|_________________________________________|
| Viteze de depunere sedimente |
|
|____________________________________|_________________________________________|
| Depuneri | 700 mc/an (100 mc/an)* solide
|
| | 17% carbon organic
|
|____________________________________|_________________________________________|
| Resuspensionari | 280 mc/an (40 mc/an)* solide
|
| | 17% carbon organic
|
|____________________________________|_________________________________________|
| Depunere neta sau ingropare | 257 mc/an (38 mc/an)* solide
|
| | 5% carbon organic
|
|____________________________________|_________________________________________|
| Evolutia apei in sol |
|
|____________________________________|_________________________________________|
| Evaporare | 90000 mc/an (270000 mc/an)* |
|____________________________________|_________________________________________|
| Scurgeri de apa | 90000 mc/an (270000 mc/an)*
|
|____________________________________|_________________________________________|
| Percolare in apa subterana | 60000 mc/an (180000 mc/an)*
|
|____________________________________|_________________________________________|
| Scurgeri solide | 90 mc/an (270 mc/an)*
|
|____________________________________|_________________________________________|
| Nivel compus din patru compartimente simple
|
|______________________________________________________________________________|
| | Volumul | Compozitia| Densitatea
|
| | (mc) | | (kg/mc)
|
|____________________________________|_______________|___________|_____________|
| Aer | 6 x 10^9 | - | 1,2
|
|____________________________________|_______________|___________|_____________|
| Apa | 7 x 10^6 | - | 1000
|
|____________________________________|_______________|___________|_____________|
| Sol | 4,5 x 10^4 | 2% carbon | 1500
|
| | | organic |
|
|____________________________________|_______________|___________|_____________|
| Sediment | 2,1 x 10^4 | 5% carbon | 1500
|
| | | organic |
|
|____________________________________|_______________|___________|_____________|
| Temperatura: 27,5 grade C 300,6 K RT = 8,314 x 300,6 = 2500
|
| Masa moleculara: 200 g/mol (in apa)
|
| Solubilitatea in apa: 20 g/mc sau mg/l 0,1 mol/mc (C^S)
|
| Presiunea de vapori: 1,0 Pa (P^S) 7,5 x 10^-3 mmHg 9,9 x 10^6 atm
|
| Log x KOW: 5 KOW = 100000
|
|______________________________________________________________________________|
| Coeficienti de partitie aer-apa si valori Z
|
|______________________________________________________________________________|
| H = P^S / C^S = 10 Pa x mc/mol
|
| KAW = H / RT = 0,004 |
| ZA (aer) = 1 / RT = 4 x 10^-4 Densitatea aer = 0,029 x 101325 / RT
|
| ZW (apa) = 1 / H = 0,1 = 1,17 kg/mc
|
|______________________________________________________________________________|
| Alte componente
|
|______________________________________________________________________________|
| Denumire | Sol | Sediment | Peste
|
|__________________|_______________________|_______________________|___________|
| Densitate ro | 1500 | 1500 | 1000
|
| (kg/mc) | | | |
|__________________|_______________________|_______________________|___________|
| Carbon organic | 0,02 | 0,04 | 0,048
|
| sau continut de | | |
|
| lipide (g/g) | | |
|
|__________________|_______________________|_______________________|___________|
| KOC sau KOL | 41000 | 41000 | 100000
|
| (ex: KOC = | | |
|
| 0,41 KOW; | | |
|
| KOL = KOW) | | |
|
|__________________|_______________________|_______________________|___________|
| KP = KOC sau KOL | 820 | 1640 | 4800
|
|__________________|_______________________|_______________________|___________|
| KPW = KP | | |
|
| ro / 1000 | | |
|
|__________________|_______________________|_______________________|___________|
| ZP = KPW x ZW | 123 | 246 | 480
|
|__________________|_______________________|_______________________|___________|
|__________________|_______________________|_______________________|___________|
| Compartiment | Aer | Apa | Sol | Sediment | Peste
|
|__________________|___________|___________|___________|___________|___________|
| Volum V (mc) |6 x 10^9 |7 x 10^6 |4,5 x 10^4 |2,1 x 10^4 |7
|
| Z (mol/mc x Pa) |4 x 10^-4 |0,1 |123 |246 |480
|
| V x Z (mol/Pa) |2,4 x 10^6 |7 x 10^5 |5,54 x 10^6|5,17 x 10^6|3360
|
|__________________|___________|___________|___________|___________|___________|
| | Cantitatea M (mol) 100
|
| | -------------------- = ------------- = 7,24 x 10^-6 =
|
| | _
|
| | >_ V x Z 1,381 x
10^7 |
| | |
| | = FUGACITATEA
|
|__________________|___________________________________________________________|
| C = Z x f |2,9 x 10^-9|7,2 x 10^-7|8,9 x 10^-4|1,8 x 10^-3|3,5 x
10^-3|
| (mol/mc) | | | | |
|
| M = C x V (mol) |17,4 |5,1 |40 |37,4 |0,024
|
| Procent |17,4 |5,1 |40 |37,4 |0,024
|
|__________________|___________|___________|___________|___________|___________|
| CG (g/mc)* |5,8 x 10^-7|1,4 x 10^-4|0,178 |0,36 |0,7
|
| Densitatea ro |1,17 |1000 |1500 |1500 |1000
|
| (kg/mc) | | | | |
|
| CU (microg/g)* |4,9 x 10^-4|1,4 x 10^-4|0,12 | 0,24 |0,7 |
|__________________|___________|___________|___________|___________|___________|
| * CG = C x Masa moleculara (g/mol)
|
| * CU = CG x 1000 / densitate (kg/mc) |
|______________________________________________________________________________|
ANEXA 2
METODOLOGIE
de evaluare a impactului substantelor periculoase din listele I si II si al
substantelor prioritare/prioritar periculoase asupra mediului acvatic prin
teste ecotoxicologice - alge verzi, dafnia, pesti
Metodologia de evaluare a impactului substantelor prioritare/prioritar
periculoase asupra mediului acvatic stabileste efectul toxic al acestor
substante asupra sistemelor biologice acvatice - alge verzi, dafnia, pestii -
contine:
A. Metodologia de determinare a toxicitatii acute asupra algelor verzi;
B. Metodologia de determinare a toxicitatii acute asupra Dafniilor;
C. Metodologia de determinare a toxicitatii acute asupra pestilor;
D. Metodologia de determinare a toxicitatii cronice asupra pestilor.
Speciile precizate pentru testele de toxicitate sunt specii comune
sistemelor ecologice acvatice din Romania, astfel: alge verzi de tipul
Scenedesmus quadricuada. Chlorella vulgaris, dafnii de tipul Daphnia magna,
pesti de tipul Cyprinus carpio.
A. Metodologia de determinare a toxicitatii acute asupra algelor verzi
A.1. Testul de inhibitie al algelor verzi
2. Caracteristici ale metodei
- determina efectele substantelor asupra cresterii algelor verzi;
- permite evaluarea efectelor substantelor la cateva generatii in 72 de
ore;
- poate fi utilizata pentru cateva tipuri de alge verzi unicelulare;
- usor de aplicat pentru substantele solubile in apa; in conditiile test,
acestea raman in apa;
- se foloseste si pentru substantele care nu interfera direct cu masurarea
cresterii algale;
- necesita cunoasterea proprietatilor fizico-chimice ale substantei de
testat - solubilitatea in apa, evaporare, stabilitate chimica, constanta de
disociere, biodegradabilitate.
- la interpretarea rezultatelor ia in calcul diferite proprietati ale
substantei - formula, gradul de puritate, natura si procentul impuritatilor,
prezenta si cantitatile de aditivi, coeficientul de partitie n-octanol/apa.
2. Definitii
Densitate celulara: numarul de celule pe mililitru;
Crestere: cresterea densitatii celulare peste perioada test;
Rata de crestere: cresterea densitatii celulare pe unitatea de timp;
EC50 - concentratia substantei care provoaca 50% reducere a cresterii
celulare (Eb x C50) sau ratei de crestere (Ef x C50) fata de celulele martor.
NOEC - concentratia cea mai mare la care nu se observa nici o inhibitie
semnificativa a cresterii algale fata de martor.
Unitate de masura: greutate pe volum (mg/l) sau greutate pe greutate (mg x
Kg^-1).
3. Substanta de referinta
Substanta de referinta poate fi testata ca un mijloc de demonstratie ca in
conditiile de laborator sensibilitatea speciei test nu se modifica
semnificativ.
Dicromatul de K poate fi folosit ca substanta de referinta.
4. Principiul metodei
O limita test poate fi realizata la 100 mg/l pentru a demonstra ca EC50
este mai mare decat aceasta concentratie.
Cresterea exponentiala a culturilor de alge verzi selectate expuse la
diferite concentratii ale substantei test se obtine in conditii bine
determinate.
Solutiile test sunt incubate pe o perioada de 72 h, timp in care densitatea
celulelor din fiecare solutie este masurata la 24 h. Inhibitia cresterii algale
este determinata fata de martor.
5. Criterii de calitate
Densitatea celulara din cultura de control ar trebui sa creasca cu un
factor de minim 16 in 3 zile.
Concentratiile substantei test vor fi mentinute la 80% fata de
concentratiile initiale tot timpul, corespunzator concentratiei nominalizate.
Pentru substantele care:
- sunt putin solubile;
- capabile sa formeze emulsii sau dispersii;
- nestabile;
se vor face solutii de fiecare data.
6. Mod de lucru
Reactivi
Solutii cu substantele test. In functie de caracteristicile substantei se
vor face solutii mama.
Mediul test
Se foloseste apa din retea (trebuie cunoscuta duritatea, pH), apa distilata
sau apa deionizata.
Aparatura
Echipament normal de laborator;
Sticle Winkler de 250 ml;
Camera de numarare:
Termoluminostat;
Agitator magnetic;
Microscop.
Organisme test
Dintre speciile de alge verzi se recomanda Selenastrum capricornutum L.,
Scenedesmus subspicatus, Scenedesmus quadricauda L.
Procedura test
Sirul concentratiilor, in care apar efectele, este determinat pe baza
rezultatelor obtinute de la mai multe serii experimentale. Doua masuratori ale
cresterii (biomasa, rata cresterii) rezulta in urma masuratorilor larg
dispersate ale inhibitiei cresterii; ambele trebuie sa fie utilizate in testul
stabilirii de domeniu pentru ca progresia geometrica a concentratiilor sa
permita estimarea atat a Eb x C50 cat si Er x E50.
Densitatea celulara initiala
Densitatea celulara initiala trebuie sa fie de aproximativ 10^4 cel/ml
Selenastrum capricornutum sau Scenedesmus subspicatus sau Scenedesmus
quadricauda. Cand sunt folosite alte specii biomasa trebuie sa fie comparabila.
Concentratiile substantei test
Pentru test se folosesc cel putin 5 concentratii in serie geometrica la o
rata a concentratiei care sa nu depaseasca 2,2. La concentratiile cele mai mici
trebuie sa nu se observe nici un efect asupra cresterii algale; cele mai mari
concentratii trebuie sa inhibe cresterea cu cel putin 50% fata de martor; in
mod ideal trebuie sa opreasca complet cresterea.
Serii si control
Testele trebuie sa includa 3 serii pentru fiecare concentratie, trei sticle
de control fara substanta si daca este necesar cu substantele aditive.
Performanta testului
Culturile test contin concentratii dorite de substante si inoculul cu alge
verzi. Sticlele sunt agitate si luminate continuu. Temperatura trebuie sa fie
21 grade - 25 grade C +/-2.
Densitatea celulara se masoara la cel putin 24 h, 48 h si 72 h de la inceperea
testului.
pH-ul se masoara la inceputul si sfarsitul testului. pH-ul de la testul de
control nu trebuie sa devieze mai mult de 1,5 unitati in timpul testului.
Test limita
Folosind procedurile descrise in aceasta metoda, o limita test poate fi
executata la 100 mg/l pentru a demonstra ca EC50 este mai mare decat aceasta
concentratie.
Daca natura substantei este de asa fel incat o concentratie de 100 mg/l in
apa test nu poate fi atinsa, testul de limita trebuie sa fie realizat la o concentratie
egala cu solubilitatea substantei (sau concentratia maxima care formeaza o
dispersie stabila) in mediul utilizat.
Testul limita trebuie sa fie realizat in cel putin 3 serii experimentale cu
acelasi numar de control.
Celelalte masuratori ale cresterii - biomasa, rata cresterii - trebuie sa
fie utilizate pentru testul limita.
Daca, intr-un test limita se constata o scadere medie de 25% sau mai mult
fie in biomasa fie in rata de crestere testul limita si testul de control,
atunci trebuie facut un nou test.
7. Evaluare si raportare
Valorile densitatii celulare din cultura test sunt trecute in tabel alaturi
de concentratii si timpul cand s-au facut masuratorile. Valorile medii ale
densitatii celulare pentru fiecare concentratie a substantei test si a
martorului sunt reprezentate pe un sistem de coordonate in functie de timp; se
obtine curba de crestere.
Pentru determinarea relatiei concentratie/efect trebuie utilizate 2
abordari. Unele substante pot stimula cresterea la concentratii mici, altele
produc inhibitii intre 0 si 100% .
Spatiul dintre curbele de crestere si linia orizontala N = N0 se calculeaza
cu formula:
N1 - N0 N1 + N2 - 2N0 N(0-1) + N0 - 2N0
A = ------- x t1 + ------------- x (t2 - t1) + .... + ----------------- x
2 2 2
x (t0 - t(0-1))
Unde:
A = zona
N0 = nr. cel/ml la timpul t0 (inceputul testului)
N1 = nr. de celule masurate / ml la t1
Nn = nr. de celule masurate ml la tn
t1 = timpul primei masuratori dupa inceputul testului
t0 = timpul ultimei masuratori dupa inceputul testului
n = numarul de masuratori facute dupa inceputul testului
Procentul inhibitiei cresterii celulare pentru fiecare concentratie a
substantei (IA) este calculat cu formula:
Ac - At
IA = ------- x 100
Ac
Unde:
Ac = zona dintre curba de crestere a martorului si linia orizontala N = N0
At = zona dintre curba de crestere la concentratia t si linia orizontala N
= N0
IA = valoarea probit care este valoarea estimata de la linia de regresie
prin citirea concentratiilor care este echivalenta cu 50% inhibitie
(IA = 50%). Denota ca aceasta valoare pentru aceasta metoda de calcul este
propusa ca sa aiba simbolul Eb x C50. Este esential ca Eb x C50 este fixata cu
perioada de expunere adecvata, de exemplu Eb x C50 (0 - 72 h)
A.2 Determinarea toxicitatii substantelor fata de algele verzi
1. Caracteristici ale metodei
- stabileste influenta toxicitatii substantelor prioritare/prioritar
periculoase asupra procesului de fotosinteza al algelor verzi de tip
Scenedesmus quadricauda L. si Chlorella vulgaris L;
- exclude erorile la citire. Metoda a fost pusa la punct de catre ICIM si
apoi a fost standardizata.
- testul se efectueaza in doua etape:
1. testul preliminar - in care se stabileste domeniul de concentratii
necesar a fi experimentat;
2. testul final - ale carui rezultate sunt inregistrate, prelucrate si
interpretate.
- se stabileste potentialul toxic al unor substante individuale sau in
amestec fata de reprezentanti ai producatorilor primari, alge verzi;
- rezultatele sunt folosite la stabilirea limitei maxime admisibile ale
substantelor in sistemele ecologice acvatice.
2. Principiul metodei
Se urmareste influenta substantelor asupra intensitatii procesului de
fotosinteza al algelor verzi, evidentiata prin reducerea productiei de oxigen;
productia de oxigen este determinata dupa 24 h, perioada de timp in care
probele au fost tinute in conditii constante de temperatura si iluminare.
Procentele de modificare a productiei de oxigen permit evaluarea gradului
de toxicitate a substantei supusa testarii, asupra organismului test.
Specii test: algele verzi - Scenedesmus quadricauda L. si Chlorella
vulgaris L. provenite din cultura de laborator; acestea sunt specii comune
sistemelor ecologice acvatice din tara noastra, raspund bine la presiunea
exercitata de substanta si se intretin relativ usor in conditii de laborator.
3. Reactivi, sticlarie de laborator si materiale
Reactivii pentru determinarea oxigenului dizolvat in apa; metoda
recomandata este STAS 6536.
Reactivii de precipitare: clorura de mangan sau sulfat de mangan, hidroxid
de sodiu sau hidroxid de potasiu si iodura de potasiu.
Reactivii de dizolvare si titrare: acid sulfuric, tiosulfat de potasiu si
amidon.
Apa pentru dilutii: apa aerata provenita din reteaua de alimentare cu grad
mijlociu de duritate (7 grade G - 8 grade G) si mineralizare redusa spre medie,
de aproximativ 300 mg/l reziduu fix
Sticle pentru oxigen, tip Winkler, cu dop slefuit si etans, cu capacitate
de 200 .... 300 ml, etalonate cu precizie pana la 0,1 ml;
Pipete de 1 ml si 2 ml cu diviziuni de cate 0,1 ml;
Biureta de 50 ml si 100 ml;
Termoluminostat
4. Mod de lucru
Din cultura de alge se pregateste o suspensie de alge verzi, cu un continut
de aproximativ 5000 celule/ml si se repartizeaza cate 50 ml din acestea la 1000
ml solutie de testat.
Se monteaza in sticle pentru oxigen, serii duble de probe, astfel:
- prima serie de probe contine apa de dilutie + suspensie de alge +
substanta toxica in diverse concentratii;
- a doua serie de probe contine apa de dilutie + substanta toxica (in
concentratii identice cu prima serie);
- se monteaza si 2 probe martor care contin: apa de dilutie, iar cealalta
apa de dilutie + suspensie de alge
Se introduc toate probele in termoluminostat, mentinandu-se timp de 24 h la
temperatura constanta de 20 grade C si iluminare permanenta de 4500 - 5000
lucsi.
Dupa perioada de incubare se determina oxigenul dizolvat; metoda
recomandata este STAS 6536.
5. Evaluarea toxicitatii substantei investigate si raportare
Se foloseste urmatoarea formula:
(OX + Ox) - (OB + Ob)
DELTAx = 100 x ---------------------
(OB - Ob)
unde:
DELTAx = modificarea productiei de O2 prin fotosinteza exprimata in % la
concentratia data;
OB = concentratia O2 din proba oarba cu alge, dupa incubare;
Ob = concentratia O2 din proba oarba, fara alge, dupa incubare
OX = concentratia O2 din proba continand substanta toxica sau amestecul de
substante si alge, dupa incubare;
Ox = concentratia O2 din proba continand substanta toxica sau amestecul de
substante, fara alge, dupa incubare.
Valorile DELTAx negative - indica o actiune toxica a substantei date iar
valorile DELTAx pozitive - indica lipsa unei actiuni toxice sau, in unele
cazuri, ca substanta respectiva are rol nutritiv si compenseaza pana la o
anumita limita efectul toxic, conform figurii 1.
^DELTAx
+ 100 |_______________>_II_________
+ 80 |____________/_______________|
+ 60 |_________/__________________|
+ 40 |__/\__/_____________________|
+ 30 |_/__/\______________________|
+ 0 |/_/___\____________>_I______|
- 30 |\_______\___________________|
- 40 |__\_______\_________________|
- 60 |____\_______\_______________|
- 80 |______\_______\>_IV_________|
- 100 |________\____>______________|
III
CONCENTRATIE
Fig. 1. Caracteristicile productiei de oxigen in cazul unei actiuni toxice
(curba III, IV), indiferente (curba I) si stimulatoare (curba II) a unei
substante
B. Metodologie de determinare a toxicitatii acute asupra Dafniilor
Testul de toxicitate acuta pentru Daphnia
1. Caracteristici ale metodei
- din modulul trofodinamic reprezentat de grupul mare al consumatorilor,
metodologia utilizeaza dafniile si pestii;
- dafniile si pestii sunt bune indicatoare ale efectelor substantelor
prioritare/prioritar periculoase pentru poluarea acvatica;
- dafniile si pestii sunt componente ale sectorului de ciclare al
substantelor prioritare/prioritar periculoase din sistemele ecologice acvatice.
2. Definitii
EC50 - LC50 pentru dafnia.
Toxicitatea acuta - concentratia medie efectiva (EC50) pentru imobilizare;
acea concentratie care imobilizeaza 50% din organismele test in timpul
perioadei test.
Imobilizare - numarul de animale care nu sunt capabile sa inoate 15 secunde
dupa o usoara agitatie in vasul test.
Unitati de masura: greutate/volum (mg/l) sau ca greutate/greutate (mg
kg^-1).
Substanta de referinta - o substanta de referinta poate fi testata ca o
metoda de a demonstra ca in conditii de laborator sensibilitatea organismelor
test nu este modificata semnificativ.
3. Principiul metodei
O limita test poate fi realizata la 100 mg/l pentru a demonstra ca EC50
este mai mare decat aceasta concentratie.
Dafniile sunt expuse timp de 48 h la substanta adaugata in diferite
concentratii in apa. Daca timpul este mai scurt, trebuie sa se precizeze in
raport.
In conditii identice de test si concentratii de substanta adecvate, la
diferite concentratii se vor obtine diferite efecte asupra capacitatii de inot
a dafniei. La concentratiile care produc 0 sau 100% imobilizare in timp de 48 h
se calculeaza EC50 daca este posibil.
Se foloseste testul static.
4. Criterii de calitate
Imobilizarea organismelor martor nu trebuie sa depaseasca 10% la sfarsitul
testului.
Organismele test nu trebuie sa fie la suprafata apei.
Se recomanda ca O2 dizolvat din vasele test sa fie peste 3 mgl^-1 si nu mai
mic de 2 mgl^-1.
Concentratiile substantei test vor fi mentinute in vase la 80% din
concentratiile initiale pe toata durata testului.
Pentru substantele care:
- sunt putin solubile;
- capabile sa formeze emulsii sau dispersii;
- nestabile.
se vor face solutii de fiecare data.
pH-ul nu trebuie sa varieze mai mult de 1 unitate.
5. Mod de lucru
Reactivi
Solutiile substantei test - se prepara in apa cunoscuta sau apa distilata
sau apa deionizata; se prepara solutia stoc, din care se fac concentratii
diferite.
Aparatura
Vase de sticla;
Oxigenometru;
Aparat pentru masurarea temperaturii;
pH-metru;
Echipament pentru masurarea duritatii apei.
Organisme test
Se recomanda utilizarea Daphnia magna Straus. Se poate folosi si Daphinia
pulex De Geer.
Organismele test trebuie sa fie mai tinere de 24 h, la inceputul testului
Procedura test
Se face un test preliminar pentru a alege scara de concentratii.
Expunerea dafniei se face astfel:
- durata: preferabil 48 h;
- numar de animale: mai putin de 20 animale, de preferat 10;
- incarcare: cel putin 2 ml de solutie test
- concentratia test; solutia test trebuie preparata inainte de introducerea
dafniilor, preferabil fara introducerea altui solvent decat apa; concentratiile
se fac geometric, la o rata a concentratiei ce nu depaseste 2,2. Concentratiile
care dau 0% si 100% imobilizare dupa 48 h si un domeniu de grade de imobilizare
intermediare care sa permita calcularea EC50 la 48 h trebuie sa fie testate
impreuna cu martorul.
Apa
Lumina - ciclul lumina - intuneric optional;
Temperatura - temperatura test trebuie sa fie 18 - 22 grade C +/-1 grad C;
Aerare - nu este necesara;
Hranire - pe durata testului nu se hranesc.
pH-ul si O2 se masoara la inceputul si sfarsitul testului;
Compusii volatili trebuie testati in vase inchise, destul de largi pentru a
preveni lipsa de O2.
Dafniile sunt urmarite cel putin 24 h si inca 48 h.
Test limita
Folosind procedurile descrise in aceasta metoda, un test limita poate fi
realizat la 100 mg/l pentru a demonstra ca EC50 este mai mare decat acea
concentratie.
Daca natura substantei este de asa fel incat o concentratie de 100 mg/l in
apa test nu poate fi obtinuta, testul limita trebuie sa fie executat la o
concentratie egala cu solubilitatea substantei sau concentratia maxima care
formeaza o dispersie stabila in mediul utilizat.
Testul limita trebuie sa foloseasca 20 dafnii, impartite in 2 sau 4 grupe,
cu acelasi numar de martori; daca apare imobilizarea trebuie repetat testul.
6. Evaluare si raportare
Pentru fiecare perioada cand se inregistreaza observatiile, respectiv 24 si
48 h procentajul de mortalitate este punctat in dreptul concentratiei pe hartie
milimetrica.
Pentru fiecare observatie de timp, EC50 si limita de confidenta (p = 0,05)
trebuie sa fie estimate folosind procedurile standard; aceste valori trebuie
rotunjite.
In acele cazuri cand panta curbei concentratiei raspuns este prea abrupta
sa permita calcularea EC50, o estimare grafica a acestei valori este
suficienta.
Cand la 2 concentratii consecutive apropiate de rata 2,2, rata de
imobilizare este numai de 0 si 100%, aceste 2 valori sunt suficiente pentru a
indica domeniul in care cade EC50.
Daca se observa ca stabilitatea sau omogenitatea substantei test nu poate
fi mentinuta, aceasta trebuie inregistrata si luata in considerare in momentul
interpretarii rezultatelor.
Raportul va cuprinde urmatoarele informatii:
- Informatii despre organismele test - nume stiintific, tulpina, sursa,
hranire;
- Apa de dilutie si caracteristicile importante - pH, temperatura,
duritate;
- Metoda de preparare a stocului si solutiilor test, pentru substantele cu
solubilitate mica in apa;
- Concentratiile oricaror substante auxiliare;
- Lista concentratiilor utilizate;
- Metode folosite si rezultatele obtinute, daca s-a efectuat analiza
chimica;
- Rezultatele testului limita, daca s-a facut;
- Descrierea echipamentului test;
- Regimul de iluminare;
- Daca au fost indeplinite criteriile de calitate;
- Un tabel care sa contina numarul de dafnii imobilizate, concentratia,
timpul;
- Graficul care reprezinta curba relatiei concentratie/raspuns la sfarsitul
testului;
- Procedura statistica de determinare a valorii EC50;
- Substanta de referinta utilizata;
- Cea mai mare concentratie care nu a indus imobilizare in timpul perioadei
test;
- Cea mai mica concentratie test care a provocat 100% imobilizare in
perioada test.
C. Metodologia de determinare a toxicitatii acute asupra pestilor
1. Caracteristici ale metodei
- determina toxicitatea acuta letala a substantelor pentru pestii din apele
de suprafata;
- necesita cunoasterea proprietatilor fizico-chimice ale substantelor
investigate: solubilitatea in apa, presiunea vaporilor, stabilitatea chimica,
biodegradabilitatea, pentru selectarea celei mai adecvate metode test -
statica, semi-statica sau curgere continua - in scopul asigurarii
concentratiilor constante de substanta pe toata durata testului;
- ofera informatii referitoare la formula chimica, gradul de puritate,
natura si procentele semnificative de impuritati, prezenta si cantitatile aditivilor,
coeficientul de partitie n-octanol/apa, trebuie luate in considerare pentru
organizarea testului si interpretarea rezultatelor.
2. Definitii
Toxicitate acuta - decelarea efectelor negative asupra organismelor intr-un
timp scurt (96 h) in prezenta substantei testate; se exprima prin concentratia
medie letala.
(CL50) - concentratia substantei din apa care omoara 50% din pestii test
intr-o perioada de expunere continua.
Unitati de masura: exprimate in greutate/volum (mg/l) sau greutate/greutate
(mg/kg).
3. Principiul metodei
O limita test poate fi efectuata la 100 mg/l substanta pentru a demonstra
ca CL50 este concentratia mai mare decat aceasta concentratie.
Pestii sunt expusi la substanta test dizolvata in apa intr-un sir
convenabil de concentratii pentru o perioada de 96 h; mortalitatile sunt
inregistrate la intervale de cel putin 24 h, iar concentratiile ce omoara 50%
din pesti (CL50) sunt necesare pentru fiecare observatie.
4. Criterii de calitate
Mortalitatile la lotul de control nu trebuie sa depaseasca 10% (sau un
peste daca sunt folositi mai putin de 10) la sfarsitul testului.
Saturatia O2 dizolvat trebuie sa fie > 60% .
Concentratiile substantelor test vor fi mentinute pana la 80% din
concentratia initiala pe toata durata testului.
Pentru substantele care se dizolva usor in mediu sau sunt stabile,
concentratia initiala este considerata fiind echivalentul concentratiei
nominale.
Se vor preciza concentratiile folosite pe toata durata testului si ce
conditii experimentale au fost indeplinite.
Pentru substante care:
- au solubilitate redusa in mediu test;
- sunt capabile sa formeze emulsii sau dispersii stabile;
- sunt nestabile in solutii apoase,
concentratia initiala va fi luata ca concentratie masurata in solutie la
inceputul testului. Concentratia va fi determinata dupa o perioada de
stabilizare, dar inainte de a introduce pestii.
In toate cazurile masuratorile ce se fac, pe toata durata testului, trebuie
sa confirme ca, la concentratia reala de expunere, pH-ul nu variaza cu mai mult
de o unitate.
5. Mod de lucru
Metoda test poate fi de 3 tipuri:
- test static - Este testul de toxicitate in care solutia test nu se
schimba (Solutiile raman neschimbate pe toata durata testului);
- test semi-static - Este testul de toxicitate, in care solutiile test sunt
innoite in mod regulat (de ex. la 24 h);
- test cu curgere continua - Testul de toxicitate in care apa este innoita
permanent in acvariile test.
Reactivi
Solutiile substantei test:
Solutia stoc - se prepara prin dizolvarea substantei in apa deionizata;
Concentratiile alese - se prepara din solutia stoc prin diluare; daca se
lucreaza cu concentratii mari, substanta poate fi dizolvata direct in apa de
dilutie.
Pentru obtinerea acestor concentratii trebuie sa se cunoasca gradul de
solubilitate. Substantele trebuie sa fie testate pana la limita de
solubilitate. Pentru unele substante, precum substantele cu solubilitate
scazuta sau cele care formeaza dispersie stabila, se prepara o concentratie
deasupra limitei de solubilitate a substantei pentru a se asigura ca se obtine
acea concentratie maxima solubila/stabila, fara ca aceasta concentratie sa
perturbe altfel sistemul (ex. filmul de substanta de la suprafata apei
impiedica oxigenarea apei). Dispersia ultrasonica poate fi utilizata, in cazul
substantelor cu solubilitate mica in apa, la prepararea solutiilor stoc.
Cand sunt folosite substante auxiliare, toate concentratiile test trebuie
sa contina aceiasi cantitate de substanta auxiliara. Martorii trebuie expusi la
aceiasi concentratie de substante auxiliare asemanatoare celor utilizate in
seriile test. Concentratia substantelor auxiliare trebuie sa fie minima, fara a
depasi 100 mg/l in mediul test.
Testul trebuie realizat fara ajustarea pH-ului. Daca exista o schimbare
evidenta a pH-ului este necesar ca testul sa se repete cu un pH ajustat, iar
rezultatele sa fie inregistrate. in acest caz valoarea pH-ului solutiei stoc
trebuie sa se ajusteze la valoarea pH-ului din apa de dilutie. Pentru acest
scop se prefera HCl si NaOH. Ajustarea pH-ului trebuie sa fie facuta astfel
incat concentratia substantei test din solutia stoc sa nu fie modificata
semnificativ. Trebuie, de asemenea, inregistrata orice reactie chimica sau
precipitare fizica a compusului test, datorate ajustarii pH-ului.
Apa de dilutie
Se foloseste apa potabila, necontaminata cu concentratii cu potential de
risc clor, metale grele sau alte substante, apa naturala de buna calitate sau
apa reconstituita. Apa trebuie sa aiba duritatea cuprinsa intre 10 si 250 mg/l
(CaCO3) si pH-ul cuprins intre 6,0 si 8,5.
Aparatura
- Toata aparatura sa fie din material inert chimic.
- Sistem automatic de dilutie
- Dozator de O2
- Echipament pentru determinarea duritatii apei
- Echipament adecvat pentru mentinerea temperaturii
- pH-metru
Pestii - test
Pestii trebuie sa fie sanatosi, fara malformatii, selectionati dupa
criterii de varsta, posibilitate de intretinere, sensibilitate relativa la
substantele chimice, comoditate pentru testare, factori economici, factori
biologici, posibilitatea de comparare a datelor obtinute cu cele existente pe
plan international.
Pregatirea materialului de experimentare
Trebuie ca pestii sa provina dintr-un singur stoc, sa aiba aproximativ
aceiasi lungime si varsta, sa fie tinuti cel putin 12 zile in conditiile
urmatoare:
- de recirculare sau curgere continua, potrivit sistemului;
- apa;
- lumina - 12 pana la 16 ore iluminare zilnica;
- concentratia O2 dizolvat: cel putin 80% saturatie;
- hranire de 3 ori pe saptamana, incetand hranirea lor cu 24 h inainte de
inceperea testului.
Mortalitate
In intervalul de 48 h de la introducerea in acvarii de acomodare se
inregistreaza mortalitatile si se aplica urmatoarele criterii:
1. mortalitati mai mari de 10% din populatie in 7 zile conduce la
eliminarea intregului lot;
2. mortalitati intre 5 si 10% din populatie conduce la continuarea
perioadei de acomodare inca 7 zile; daca nu se mai inregistreaza mortalitati,
lotul este acceptat, altfel este eliminat intregul lot.
3. mortalitati mai mici de 5% din populatie conduce la acceptarea
intregului lot.
Adaptare
Toti pestii trebuie mentinuti in apa de calitate si temperatura constanta
timp de 7 zile, inainte de inceperea testului.
Procedura test
Se face un test preliminar cu scopul de a obtine informatii despre sirul de
concentratii ce trebuie utilizat in testul principal.
In cazul in care sunt folosite substante auxiliare pentru marirea gradului
de solubilitate a substantelor greu solubile se monteaza o proba martor (test
de control).
In functie de proprietatile fizico-chimice ale substantei test trebuie
selectata cea mai adecvata dintre metodele enuntate mai sus.
Pestii sunt expusi la actiunea substantelor dupa cum urmeaza:
- durata - 96 h;
- numar pesti: cel putin 7 pentru fiecare concentratie;
- acvarii de capacitate convenabila in relatie cu incarcarea cu animale de
experimentare;
- incarcare: maxim 1 g/l pentru teste statice si semi-statice, iar pentru
cele cu curgere continua incarcarea poate fi mai mare;
- concentratia test: cel putin 5 concentratii care diferentiate printr-un
factor de maxim 2,2 si pe cat posibil extinse pe domeniul care sa acopere de la
0 la 100% mortalitate;
- apa: vezi pct. 7;
- lumina: 12 pana la 16 h zilnic;
- temperatura: conform speciei, dar +/-1 grad C in orice test;
- concentratia O2 dizolvat: nu mai putin de 60% saturatie O2;
- hranire: nu.
Pestii sunt urmariti dupa primele 2 - 4 ore si cel putin la intervale de 24
ore. Pestii sunt considerati morti, daca la atingerea inotatoarei codale nu
apare nici o reactie si nu sunt vizibile miscarile respiratorii. Se noteaza
pestii morti si sunt indepartati din acvarii. Se noteaza si anomaliile vizibile
pierderea echilibrului, inotul, functia respiratorie, pigmentatia
Zilnic se masoara pH, O2 dizolvat, temperatura.
Test limita
Folosind procedurile descrise, o limita test poate fi stabilita la 100 mg/l
pentru a demonstra ca CL50 este mai mare decat aceasta concentratie.
Daca natura substantei este astfel incat o concentratie 100 mg/l in apa
test nu poate fi atinsa, limita test trebuie stabilita la o concentratie egala
cu solubilitatea substantei sau maxim de concentratie ce formeaza o dispersie
stabilita in mediul folosit.
Pentru testul limita se foloseste acelasi numar de pesti - 7 - 10 pesti -
ca si pentru testul martor; teoria distributiei binomiale stabileste ca in
cazul cand se folosesc 10 pesti cu zero mortalitate exista un grad de incredere
de 99,9% ca CL50 este mai mare decat concentratia folosita in testul limita.
Daca se folosesc 7 - 8 - 9 pesti, absenta mortalitatii asigura un grad de incredere
de cel putin 99% insemnand ca CL50 este mai mare decat concentratia folosita.
Daca se instaleaza letalitati, trebuie dezvoltat un studiu complex. Daca
sunt observate efecte subletale acestea trebuie notate.
6. Evaluare si raportare
Pentru fiecare perioada pentru care s-au facut observatii se reprezinta
grafic procentul de mortalitate (24, 48, 72 si 96 h) pentru fiecare perioada de
expunere fata de concentratie in scara logaritmica.
Cand este posibil si pentru fiecare timp de observatie, CL50 si limitele de
confidenta (p = 0,05) trebuie estimate prin folosirea procedurilor standard;
aceste valori trebuie rotunjite la unitate sau la mai mult de 2 cifre
semnificative.
In acele cazuri in care panta curbei concentratie/mortalitate este prea
inclinata pentru a permite calculul lui CL50, o estimare grafica a acestei
valori este suficienta.
Cand 2 concentratii consecutive intr-un raport de 2,2 dau numai 0% si 100%
mortalitate, aceste 2 valori sunt suficiente pentru a indica intervalul in care
se situeaza CL50.
Daca s-a observat ca stabilitatea si omogenitatea substantei test nu poate
fi mentinuta, aceasta trebuie notata si avuta in vedere la interpretarea
rezultatelor.
Raportul trebuie sa includa urmatoarele informatii:
- informatii privitoare la organismele test - nume stiintific, specie, gen,
marime, numarul folosit pentru fiecare concentratie;
- sursa pentru apa de dilutie si caracteristicile chimice principale - pH,
duritate, temperatura;
- in cazul substantelor cu solubilitate scazuta in apa, se trece metoda de
preparare a solutiei stoc si a solutiilor test;
- concentratia oricarei substante auxiliare;
- lista de concentratii folosite si orice alte informatii utilizabile
privitoare la stabilitatea concentratiilor substantelor chimice testate in
solutia test;
- daca se fac analize chimice sunt date metodele utilizate si rezultatele
obtinute;
- rezultatul testului limita daca s-a efectuat;
- motivatia alegerii si detaliile procedurii test utilizate (static,
semi-static, cu curgere continua, doza - rata, viteza curgerii, incarcarea cu
pesti, daca apa este aerata);
- descrierea echipamentului;
- regimul de iluminare;
- concentratia O2 dizolvat, valorile pH si temperatura la fiecare 24 h;
- evidenta ca criteriile de calitate au fost indeplinite;
- un tabel ce indica mortalitatea cumulativa la fiecare concentratie si la
martor (si martor pentru substanta auxiliara folosita, daca se cere) la fiecare
timp de observatie recomandat;
- graficul curbei concentratie/procentaj raspuns la sfarsitul testului;
- valorile CL50 la fiecare timp de observatie recomandat (cu 95% limita de
confidenta);
- procedurile statistice utilizate pentru determinarea LC50;
- daca este folosita o recomandare privitoare la substanta, trebuie
mentionat rezultatul obtinut;
- concentratia cea mai mare a testului, care nu provoaca mortalitate pe
toata durata testului;
- cea mai mica concentratie ce provoaca 100% mortalitate pe perioada
testului.
D. Metodologia de determinare a toxicitatii cronice asupra pestilor -
metoda de colorare hematoxilina eozina
1. Principiul metodei
Pentru evidentierea efectelor cronice ale substantelor prioritare/prioritar
periculoase s-a ales metoda de colorare hematoxilina - eozina, fiind o metoda
accesibila, permitand decelarea efectelor structurale la nivelul mai multor
organe vitale - branhie, intestin subtire, ficat, rinichi, musculatura.
Utilizarea acestei metode necesita personal special calificat, deoarece nu
este o metoda de rutina.
2. Mod de lucru
Reactivi
alcool etilic absolut
formol
acetona
benzen
hematoxilina
eozina
albumina
parafina
Aparatura
microtom;
termostat cu includere in parafina
plita pentru intinderea sectiunilor
microscop
aparat de fotografiat
Sticlarie
vase Borel
lame
lamele
Specia test - Cyprinus carpio L (crap).
Metodologia de intoxicare
Lotul de pesti supus experimentarii a fost introdus in acvarii cu
capacitatea de 30 l; in fiecare acvariu s-au introdus cate 20 de organisme.
Concentratiile utilizate sunt subletale; alegerea concentratiilor depinde
de caracteristicile substantei investigate.
Testele cronice se desfasoara in regim static.
Metoda de prelevare
Prelevarea pestilor intoxicati pentru investigatiile histopatologice se
face la intervale de 30 zile.
Procedura test
Recoltarea pestilor pentru analiza histopatologica se face la 30, 60, 90,
120 si respectiv 150 zile minim pana la maxim un an.
Obtinerea preparatelor histologice - impune recoltarea fragmentelor de
organe si prelucrarea lor dupa o tehnica de prelucrare histopatologica.
Dupa disectia pestelui se preleveaza fragmente de branhii, ficat, intestin
subtire, rinichi, musculatura, deoarece sunt organe vitale si totodata organe
tinta pentru orice substanta care se acumuleaza sau are efect toxic.
Fixare
Fragmentele de organe obtinute in urma disectiei sunt fixate in formol 10%,
pentru oprirea proceselor de degradare ce survin dupa moarte.
Deshidratare si clarificare
Dupa fixare, piesele sunt deshidratate in baie de alcool etilic, de
concentratii crescatoare (70 grade, 90 grade, 100 grade); dupa deshidratare
fragmentele de organe sunt clarificate in acetona si benzen.
Piesele deshidratate si clarificate sunt incluse in parafina si mentinute
la temperatura constanta de 57 grade C.
Blocurile de parafina, ce contin fragmentele de organe, sunt sectionate la
microtom; grosimea sectiunilor este cuprinsa intre 5 - 6 micro.
Colorare cu hematoxilina eozina
Sectiunile sunt intinse pe lame unse cu albumina Mayer si sunt tinute la
termostat cu includere in parafina 5 - 24 h, la o temperatura constanta de 37
grade C.
Pentru decelarea efectelor produse de substantele investigate este necesara
colorarea sectiunilor si obtinerea preparatelor fixe.
In acest sens, lamele cu sectiunile de organe sunt deparafinate in benzen.
Apoi sunt trecute prin bai succesive de alcool etilic de concentratii
descrescatoare (100 grade, 90 grade, 70 grade), cu scopul de a elimina
solventul parafinei, ultima baie fiind cu apa distilata.
Sectiunile sunt colorate cu hematoxilina si eozina. Acesti coloranti
evidentiaza componentele celulare, ca nucleul si citoplasma.
Dupa colorare, sectiunile sunt deshidratate in alcool etilic de
concentratii crescatoare (70 grade, 90 grade, 100 grade) si clarificate in
benzen.
Preparatele microscopice sunt montate in balsam de Canada devenind
preparate fixe.
3. Examinare si raportare
Se realizeaza examinarea la microscopul optic si se compara cu martorul.
Modificarile celulare se descriu detaliat si se fotografiaza.