ORDIN   Nr. 22 din 1 februarie 2007

privind aprobarea Normei sanitare veterinare ce stabileste metode de analiza pentru controlul oficial al furajelor privind nivelurile amidonului, proteinei brute, proteinei brute care poate fi dizolvata de pepsina si acid clorhidric, gosipolului liber si total si cu referire la activitatea pepsinei, precum si determinarea nivelurilor de tilozina si virginiamicina din furaje

ACT EMIS DE: AUTORITATEA SANITARA VETERINARA SI PENTRU SIGURANTA ALIMENTE

ACT PUBLICAT IN: MONITORUL OFICIAL  NR. 141 din 27 februarie 2007

Văzând Referatul de aprobare nr. 70.058 din 22 ianuarie 2007, întocmit de Direcţia de control şi coordonare a activităţii farmaceutice veterinare din cadrul Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor,

având în vedere prevederile art. 10 lit. b) din Ordonanţa Guvernului nr. 42/2004 privind organizarea activităţii sanitar-veterinare şi pentru siguranţa alimentelor, aprobată cu modificări şi completări prin Legea nr. 215/2004, cu modificările şi completările ulterioare,

în temeiul art. 3 alin. (3) şi al art. 4 alin. (3) din Hotărârea Guvernului nr. 130/2006 privind organizarea şi funcţionarea Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor şi a unităţilor din subordinea acesteia,

preşedintele Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor emite următorul ordin:

Art. 1. - Se aprobă Norma sanitară veterinară ce stabileşte metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor privind nivelurile amidonului, proteinei brute, proteinei brute care poate fi dizolvată de pepsină şi acid clorhidric, gosipolului liber şi total şi cu referire la activitatea pepsinei, precum şi determinarea nivelurilor de tilozină şi virginiamicină din furaje, prevăzută în anexa care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art. 2. - Autoritatea Naţională Sanitară Veterinară şi pentru Siguranţa Alimentelor, institutele veterinare centrale şi direcţiile sanitar-veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene şi a municipiului Bucureşti vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art. 3. - La data intrării în vigoare a prezentului ordin se abrogă Ordinul ministrului agriculturii, pădurilor, apelor şi mediului nr. 968/2003 privind aprobarea Normei sanitare veterinare ce stabileşte metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor privind amidonul, proteina brută, proteina brută descompusă de pepsină şi acid clorhidric, estimarea activităţii pepsinei, a gosipolului liber şi cu referire la identificarea antibioticelor din grupul tetraciclinelor, al clortetraciclinelor, oxitetraciclinelor şi tetraciclinelor, a oleandomicinei şi a virginiamicinei, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 59 şi 59 bis din 23 ianuarie 2004.

Art. 4. - Prezentul ordin transpune prevederile Directivei Comisiei 72/199/CEE ce stabileşte metode comunitare de analiză pentru controlul oficial al furajelor, publicată în Jurnalul Oficial al Comunităţilor Europene (JOCE) nr. L 123 din 29 mai 1972, p. 6, astfel cum a fost modificată ultima dată de Directiva Comisiei 1999/79/CE, publicată în Jurnalul Oficial al Comunităţilor Europene (JOCE) nr. L 209 din 7 august 1999, p. 23.

Art. 5. - Prezentul ordin va fi publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Preşedintele Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor,

Marian Avram

ANEXA

NORMĂ   SANITARĂ   VETERINARĂ

ce stabileşte metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor privind nivelurile amidonului, proteinei brute, proteinei brute care poate fi dizolvată de pepsină şi acid clorhidric, gosipolului liber şi total şi cu referire la activitatea pepsinei, precum şi determinarea nivelurilor de tilozină şi virginiamicină din furaje

Art. 1. - Analizele pentru controalele oficiale ale furajelor, în ceea ce priveşte nivelurile acestora de amidon, proteină brută, proteină brută ce poate fi descompusă de pepsină şi acid clorhidric, de gosipol liber sau total şi în ceea ce priveşte activitatea pepsinei, se efectuează utilizându-se metodele descrise în anexa nr. 1.

Art. 2. - Analizele pentru controalele oficiale ale furajelor, în ceea ce priveşte determinarea nivelurilor de tilozină şi virginiamicină din furaje, se efectuează utilizându-se metodele descrise în anexa nr. 2.

Art. 3. - Autoritatea Naţională Sanitară Veterinară şi pentru Siguranţa Alimentelor informează Comisia Europeană cu privire la actele normative şi prevederile administrative necesare pentru implementarea prezentei norme sanitare veterinare.

Art. 4. - Anexele nr. 1 şi 2 fac parte integrantă din prezenta normă sanitară veterinară.

ANEXA Nr. 1 la norma sanitară veterinară

I. DETERMINAREA AMIDONULUI

Metoda polarimetrică

1.  Scop şi domeniu de aplicare

Această metodă se utilizează pentru determinarea nivelurilor de amidon şi a produselor de degradare a amidonului cu greutate moleculară mare din furaje, în scopul verificării conformităţii cu Norma veterinară ce stabileşte metoda de calcul pentru valoarea energetică a furajelor combinate pentru păsări, aprobată prin Ordinul preşedintelui Agenţiei Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor nr. 17/2004, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 şi 1.020 bis din 4 noiembrie 2004, ce transpune în legislaţia naţională Directiva Comisiei 86/174/CEE, şi cu Norma sanitară veterinară privind circulaţia şi utilizarea materiilor prime furajere, aprobată prin Ordinul ministrului agriculturii, pădurilor, apelor şi mediului nr. 507/2003, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 683 şi 683 bis din 29 septembrie 2003, ce transpune în legislaţia naţională Directiva Consiliului 96/25/CE.

2.  Principiu

Metoda cuprinde două etape. In prima etapă, proba se tratează, atunci când este fierbinte, cu acid clorhidric diluat. După clarificare şi filtrare, rotaţia optică a soluţiei trebuie măsurată prin polarimetrie.

In a doua etapă, proba trebuie extrasă cu etanol 40%. După acidifierea filtratului cu acid clorhidric, clarificând şi filtrând soluţia, rotaţia optică se măsoară ca în prima etapă.

Conţinutul în amidon al probei se calculează făcându-se diferenţa dintre cele două măsurători, multiplicată cu un factor cunoscut.

3.  Reactivi

3.1.  Acid clorhidric (w/w) 25%, d: 1,126 g/ml

3.2.  Acid clorhidric (w/v) 1,128%

Concentraţia trebuie să fie controlată prin titrare, utilizându-se o soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 mol/litru în prezenta de roşu de metil (w/v) 0,1% în etanol 94% (V/V). 10 ml = 30,94 ml de NaOH 0,1 mol/litru

3.3.   Soluţie Carrez I: Se dizolvă în apă 21,9 g acetat de zinc Zn(CH₃COO)₂. 2H₂O şi 3g de acid acetic glacial. Se aduce la volum până la 100 ml cu apă

3.4.   Soluţie Carrez II: Se dizolvă în apă 10,6 g de ferocianură de potasiu [K₄(Fe(CN)₆]. 3H₂O. Se aduce la volum până la 100 ml cu apă

3.5.   Etanol 40% (v/v), d : 0,948 g/ml la 20°C.

4. Aparatură

4.1.  Retortă Erlenmeyer de 250 ml cu ajustare de sticlă mată standard şi cu condensator de reflux

4.2.   Polarimetru sau sacharimetru

5.  Procedură

5.1.   Prepararea probei

Se mărunţeşte proba până când este destul de fină pentru a trece printr-o sită cu ochiuri de 0,5 mm.

5.2.   Determinarea rotaţiei optice totale (P sau S) (Vezi observaţia 7.1)

Se cântăresc 2,5 g din proba mărunţită, cu o aproximaţie de mg, şi se plasează într-o retortă gradată de 100 ml. Se adaugă 25 ml de acid clorhidric (pct. 3.2), se agită pentru a se obţine chiar distribuţia probei-test şi se adaugă încă 25  ml  de  acid  clorhidric  (pct.  3.2).   Se imersează retorta în apă fiartă, agitându-se energic şi constant timp de 3 minute, pentru a se preveni formarea de flocoane. Cantitatea de apă din baia de apă trebuie să fie suficientă pentru ca baia să rămână la punctul de fierbere, atunci când retorta este introdusă în aceasta.

Retorta nu trebuie să fie scoasă din baie cât timp se agită. După exact 15 minute, se scoate retorta din baie, se adaugă 30 ml de apă rece şi se răceşte imediat la 20°C.

Se adaugă 5 ml de soluţie Carrez I (pct. 3.3) şi se agită timp de un minut. Apoi se adaugă 5 ml de soluţie Carrez II (pct. 3.4) şi se agită din nou, timp de un minut. Se aduce la volum cu apă, se omogenizează şi se filtrează. Dacă filtratul nu este perfect clar (fapt ce este rar), se repetă determinarea utilizându-se o cantitate mai mare de soluţii Carrez I şi II, de exemplu 10 ml.

Se măsoară rotaţia optică a soluţiei într-un tub de 200 mm cu polarimetru sau cu sacharimetru.

5.3. Determinarea rotaţiei optice (P' sau S') a substanţelor solubile în etanol 40%

Se cântăresc 5 g din probă cu o aproximaţie de mg, se plasează într-o retortă gradată de 100 ml şi se adaugă aproximativ 80 ml de etanol (pct. 3.5) (vezi observaţia 7.2). Se lasă retorta să stea timp de o oră la temperatura camerei. In acest timp, se agită puternic de 6 ori, astfel încât proba-test este bine amestecată cu etanol. Se aduce la volum cu etanol (pct. 3.5), se omogenizează şi se filtrează.

Se picură 50 ml din filtrat (= 2,5 g din probă) într-o retortă Erlenmeyer de 250 ml, se adaugă 2,1 ml de acid clorhidric (pct. 3.1) şi se agită cu vigoare. Se echipează retorta Erlenmeyer cu un condensator de reflux şi se imersează acesta din urmă într-o baie de apă fierbinte. După exact 15 minute se îndepărtează retorta Erlenmeyer din baie, se transferă conţinutul într-o retortă gradată de 100 ml, clătindu-se cu puţină apă rece, şi se răceşte la 20°C. Se clarifică filtratul utilizându-se soluţiile Carrez I (pct. 3.3) şi II (pct. 3.4), se aduce la volum cu apă, se omogenizează, se filtrează şi se măsoară rotaţia optică, aşa cum s-a indicat la pct. 5.2.

6. Calcularea rezultatelor

Conţinutul de amidon (%) este calculat după cum urmează:

6.1. Măsurare cu polarimetru

Conţinut de amidon

unde:

P = rotaţia optică totală în grade;

P'= rotaţia optică în grade a substanţelor solubile în etanol 40%'(V/V);

 = rotaţie optică specifică de amidon pur. Valorile numerice acceptate convenţional pentru acest factor sunt următoarele:

+ 185,9°: amidon din orez;

+ 185,4°: amidon din cartofi;

+ 184,6°: amidon din porumb;

+ 182,7°: amidon din grâu;

+ 181,5°: amidon din orz;

+ 181,3°: amidon din ovăz;

+ 184,0°: alte tipuri de amidon şi amestecuri de amidon din furaje combinate.

6.2.  Măsurarea cu zaharimetru

Continut de amidon = 2000_  x (2N x 0,665) x (S - S')  - 26,6 N x (S - S')

                                                   100                             

unde:

S = rotaţia optică totală în grade zaharimetrice;

S' = rotaţia optică în grade zaharimetrice a substanţelor solubile în etanol 40% (V/V);

N = greutatea în grame a sucrozei în 100 ml de apă, ce dă o rotaţie optică de 100 grade zaharimetrice, atunci când este măsurată utilizând un tub de 200 mm. Greutatea variază după cum urmează, în conformitate cu tipul de zaharimetru utilizat:

-   16,29 g pentru zaharimetrele franceze;

-  26,00 g pentru zaharimetrele germane; - 20,00 g pentru zaharimetrele mixte;

 = rotaţie optică specifică a amidonului pur (vezi pct. 6.1).

6.3.  Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe aceeaşi probă trebuie să fie de maximum 0,4, în valoare absolută, pentru un conţinut de amidon mai mic de 40% şi 1,1%, în valoare relativă, pentru conţinuturi de amidon de minimum 40%.

7. Observaţii

7.1.   Dacă proba conţine mai mult de 6% carbonaţi, calculaţi în termeni de carbonat de calciu, aceştia trebuie să fie distruşi prin tratament cu exact cantitatea corespunzătoare de diluţie de acid sulfuric, înainte de determinarea rotaţiei optice totale.

7.2.   In cazul produselor cu un conţinut ridicat de lactoză, precum zerul pudră sau laptele praf degresat, se procedează după cum urmează: după ce se adaugă 80 ml de etanol (pct. 3.5), se echipează retorta cu un condensator de reflux şi se imersează aceasta din urmă într-o baie cu apă la 50°C, timp de 30 de minute. Se lasă să se răcească şi se continuă analiza aşa cum s-a indicat la pct. 5.3.

7.3.   In cazul în care următoarele materii furajere sunt prezente în cantitate semnificativă în furaje, pot apărea interferenţe atunci când se determină conţinutul de amidon prin metoda polarimetrică şi, de aceea, pot fi obţinute rezultate incorecte:

a)   produse din sfeclă (de zahăr), cum ar fi: pulpă de sfeclă (de zahăr), melasă de sfeclă (de zahăr), pulpă melasată de sfeclă (de zahăr), borhot de sfeclă (de zahăr), zahăr (de sfeclă);

b)  pulpă de citrice;

c)  sămânţă de in; turte de in obţinute prin presare; turte de in rezultate după extracţie;

d)   sămânţă de rapiţă; turte de rapiţă obţinute prin presare; turte de rapiţă rezultate după extracţie; hoaspe de sămânţă de rapiţă;

e)  sămânţă de floarea-soarelui; turte de floarea-soarelui rezultate după extracţie; sămânţă de floarea-soarelui parţial decorticată, extrasă;

f)  turte de copra obţinute prin presare; turte de copra rezultate după extracţie;

g)  pulpă de cartof;

h) drojdie deshidratată;

i) produse bogate în inulină (de exemplu, tăiţei şi făină de topinambur); j) jumări.

II. DETERMINAREA PROTEINEI BRUTE

1. Scop şi domeniu de aplicare

Această metodă se utilizează pentru determinarea conţinutului de proteină brută din furaje pe baza conţinutului de azot, determinat în conformitate cu metoda Kjeldahl.

2.  Principiu

Proba se digeră cu acid sulfuric în prezenţa unui catalizator. Soluţia acidă trebuie alcalinizată cu soluţie de hidroxid de sodiu. Amoniacul se distilează şi se colectează într-o cantitate măsurată de acid sulfuric, al cărui exces este titrat cu o soluţie standard de hidroxid de sodiu.

3.  Reactivi

3.1.  Sulfat de potasiu

3.2.   Catalizator: oxid de cupru (II) CuO sau sulfat de cupru pentahidrat (II), CuSO₄ . 5H₂ O

3.3.  Zinc granulat

3.4.  Acid sulfuric, p₂₀ = 1,84g/ml

3.5.  Acid sulfuric C(1/2H₂S0₄) = 0,5 mol/l

3.6.  Acid sulfuric C(1/2H₂SO₄) = 0,1 mol/l

3.7.   Indicator roşu de metil: se dizolvă 300 mg de roşu de metil în 100 ml de etanol,σ = 95-96% (v/v)

3.8.  Soluţie de hidroxid de sodiu (poate fi utilizat gradul tehnic) β= 40g/100ml (m/v: 40%)

3.9.  Soluţie   c   de hidroxid de sodiu = 0,25ml/l

3.10.  Soluţie   c de hidroxid de sodiu = 0,1 mol/l

3.11.   Piatră ponce granulată, spălată în acid clorhidric şi aprinsă

3.12.  Acetanilidă ( m.p. = 114°C, N = 10,36%)

3.13.  Sucroză (liberă de azot).

4. Aparatură

Aparatură potrivită pentru efectuarea digestiei, distilării şi titrării, în conformitate cu procedura Kjedahl.

5.  Procedură

5.1.  Digestie

Se cântăreşte 1 g de probă cu o aproximaţie de 0,001 g şi se transferă în retorta aparatului de digestie. Se adaugă 15 g de sulfat de potasiu (pct. 3.1), o cantitate corespunzătoare de catalizator (pct. 3.2) [0,3 până la 0,4 g de oxid de cupru (II) sau 0,9 până la 1,2 g de sulfat de cupru pentahidrat(II)], 25 ml de acid sulfuric (pct. 3.4) şi câteva granule de piatră ponce (pct. 3.11) şi se amestecă. Se încălzeşte mai întâi retorta cu moderaţie, rotindu-se din când în când, dacă este necesar, până când masa de probă s-a carbonizat şi spuma a dispărut. Se încălzeşte apoi mai intens până când lichidul fierbe constant. Incălzirea este adecvată dacă acidul fiert condensează pe peretele retortei. Se previne ca pereţii să devină supraîncălziţi şi ca particule organice să se lipească pe aceştia. Când soluţia devine clară şi verde deschis, se continuă să se fiarbă timp de încă două ore, apoi se lasă să se răcească.

5.2.  Distilare

Se adaugă cu grijă destulă apă pentru dizolvarea completă a sulfaţilor. Se lasă să se răcească şi apoi se adaugă câteva granule de zinc (pct. 3.3).

Se plasează în retorta de colectare a aparatului de distilare o cantitate exactă măsurată de 25 ml de acid sulfuric (pct. 3.5 sau 3.6), depinzând de conţinutul de azot estimat. Se adaugă câteva picături de indicator de roşu de metil (pct. 3.7).

Se conectează retorta de digestie la condensatorul aparatului de distilare şi se imersează porţiunea terminală a condensatorului în lichidul conţinut în retorta de colectare, la o adâncime de cel puţin 1 cm (vezi observaţia de la pct. 8.3). Se toarnă încet 100 ml de soluţie de hidroxid de sodiu (pct. 3.8) în retorta de digestie, fără a se pierde amoniac (vezi observaţia de la pct. 8.1).

Se încălzeşte retorta până când amoniacul s-a distilat.

5.3.  Titrare

Se titrează excesul de acid sulfuric în retorta de colectare cu soluţie de hidroxid de sodiu (pct. 3.9 sau 3.10), depinzând de concentraţia de acid sulfuric utilizată, până când este atins punctul final.

5.4.  Test martor

Pentru a se confirma că reactivii sunt liberi de azot, se efectuează un test martor (digestie, distilare şi titrare), utilizându-se 1  g de sucroză (pct. 3.13) în locul probei.

6. Calcularea rezultatelor

Conţinutul în proteină brută este calculat în conformitate cu următoarea formulă:

(V₀ - V₁) x c x 0,014 x 100 x 6,25

                       m

unde:

V₀ = volumul (ml) de NaOH (pct. 3.9 sau pct. 3.10) utilizat la testul martor;

V₁ = volumul (ml) de NaOH (pct. 3.9 sau pct. 3.10) utilizat la titrarea probei;

c = concentraţia (mol/l) de hidroxid de sodiu (pct. 3.9 sau pct. 3.10);

m = masa probei (g).

7. Verificarea metodei

7.1.   Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele, efectuate pe aceeaşi probă, trebuie să fie de maximum:

-   0,2% în valoare absolută, pentru un conţinut de proteină brută mai mic de 20%;

-  1,0% relativ la valoarea mai mare, pentru un conţinut de proteină brută de la 20% la 40%;

-   0,4% în valoare absolută, pentru un conţinut de proteină brută de peste 40%.

7.2.  Acurateţe

Se efectuează analiza (digestie, distilare şi titrare) pe 1,5 până la 2 g de acetanilidă (pct. 3.12), în prezenţa a 1 g de sucroză (pct. 3.13); 1 g de acetanilidă consumă 14,8 ml de acid sulfuric (pct. 3.5). Recuperarea trebuie să fie de cel puţin 99%.

8. Observaţii

8.1.  Aparatura poate fi de tip manual, semiautomat sau automat. Dacă aparatura necesită transferul între fazele de digestie şi de distilare, acest transfer trebuie să fie efectuat fără pierdere. Dacă retorta aparatului de distilat nu este echipată cu o pâlnie, se adaugă imediat, înainte de conectarea retortei la condensator, hidroxid de sodiu, turnând încet pe pereţi.

8.2.   Dacă materialul digerat se solidifică, se reîncepe determinarea, utilizându-se o cantitate mai mare de acid sulfuric (pct. 3.4) decât cea specificată anterior.

8.3.   Pentru produse cu un conţinut scăzut de azot, volumul de acid sulfuric (pct. 3.6) ce trebuie plasat în retorta de colectare poate fi redus până la 10 sau 15 ml, dacă este necesar, si se aduce la volum cu apă până la 25 ml.

III. DETERMINAREA PROTEINEI BRUTE DESCOMPUSE DE PEPSINĂ Şl ACID CLORHIDRIC

1. Scop şi domeniu de aplicare

Această metodă se utilizează pentru determinarea fracţiunii de proteină brută descompusă de pepsină şi acid clorhidric în baza condiţiilor definite. Aceasta este aplicabilă tuturor furajelor.

2.  Principiu

Proba trebuie încălzită timp de 48 de ore, la 40°C, într-o soluţie clorhidrică de pepsină. Suspensia trebuie filtrată, iar conţinutul în azot al filtratului, determinat în conformitate cu metoda pentru determinarea proteinei brute.

3.  Reactivi

3.1.  Acid clorhidric, d: 1,125

3.2.  Acid clorhidric, 0,075 N

3.3.    2,0 U/mg pepsină. Activitatea pepsinei este definită de metoda descrisă în partea a 4-a a acestei anexe şi trebuie să fie stabilită în conformitate cu acea metodă.

3.4.   Aproximativ 0,2% (w/v) soluţie proaspăt preparată de acid clorhidric (pct. 3.2); Activitate: 400 U/L

3.5.  Emulsie antispumă (de exemplu, silicon).

3.6.  Toţi reactivii menţionaţi la pct. 3 pentru metoda de determinare a proteinei brute.

4. Aparatură

4.1.   Baie de apă sau incubator, fixat la 40°C ± 1°C

4.2.  Aparatură de digestie şi de distilare Kjedahl.

5.  Procedură

5.1.  Prepararea soluţiei (vezi observaţia 7.2)

Se cântăresc 2 g din probă, cu o aproximaţie de mg, şi se plasează într-o retortă gradată de 500 ml. Se adaugă 450 ml de soluţie clorhidrică de pepsină (pct. 3.4), încălzită anterior la 40°C, şi se agită pentru a se preveni formarea flocoanelor. Se controlează ca ph-ul suspensiei să fie mai mic de 1,7. Se plasează retorta într-o baie de apă sau incubator (pct. 4.1) şi se lasă acolo timp de 48 de ore. Se agită după 8, 24 şi 32 de ore. După 48 de ore se adaugă 15 ml de acid clorhidric (pct. 3.1), se răceşte până la 20°C, se aduce la volum cu apă şi se filtrează.

5.2.  Digestia

Se iau 250 ml de filtrat şi se plasează în retorta aparatului de distilare (pct. 4.2). Se adaugă reactivii necesari pentru digestia indicată în a doua propoziţie a pct. 5.1 din metoda pentru determinarea proteinei brute. Se omogenizează şi se aduce la fierbere. Dacă se formează orice spumă, se adaugă câteva picături de emulsie antispumă (pct. 3.5). Se continuă fierberea cu vigoare până când apa s-a evaporat aproape complet. Se reduce căldura şi se elimină cu atenţie ultimele urme de apă.

Când soluţia devine clară şi incoloră (sau verde deschis, dacă este utilizat un catalizator pe bază de cupru), se continuă fierberea timp de încă o oră. Se lasă să se răcească.

5.3.  Distilare şi titrare

Se procedează, aşa cum s-a indicat la pct. 5.2 şi 5.3 din metoda pentru determinarea proteinei brute.

5.4.  Test martor

Se efectuează un test martor, aplicându-se aceeaşi procedură, dar omiţându-se proba ce trebuie analizată.

6. Calcularea rezultatelor

Se scade volumul de acid sulfuric consumat la testul martor din cel consumat la proba-test. 1 ml de acid sulfuric 0,1 N corespunde la 1,4 mg de azot.

Se multiplică cantitatea de azot cu factorul 6,25. Se exprimă rezultatul ca   procent din probă.

Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele, efectuate pe aceeaşi probă, trebuie să fie de maximum:

-  0,4, în valoare absolută, pentru un conţinut mai mic de 20%;

-   2,0%, în valoare absolută, pentru un conţinut peste 20% şi nu mai mult de 40%;

-   0,8, în valoare absolută, pentru un conţinut de peste 40%.

7. Observaţii

7.1.   Valorile obţinute prin această metodă nu au conexiune directă cu digestibilitatea in vivo.

7.2.   Produsele cu un conţinut în ulei sau grăsime ce depăşeşte 10% trebuie mai întâi să fie degresate prin extracţie cu eter petrol (B.P. 40°C până la 60°C).

IV. ESTIMAREA ACTIVITĂŢII PEPSINEI

1. Scop şi domeniu de aplicare

Această metodă se utilizează la stabilirea activităţii de pepsină utilizată în determinarea proteinei brute descompuse de pepsină şi acid clorhidric.

2.  Principiu

Hemoglobina trebuie tratată cu pepsină, într-un mediu de acid clorhidric, în baza condiţiilor definite. Fracţiunea nehidrolizată a proteinei este precipitată în acid tricloracetic. Sunt adăugate filtratului hidroxid de sodiu şi reactiv Folin-Ciocalteu. Densitatea optică a acestei soluţii trebuie măsurată la lungimea de undă de 750 nm, iar cantitatea corespunzătoare de tirozina trebuie citită de pe curba de calibrare.

Definiţie: Unitatea de pepsină este definită ca fiind cantitatea din acea enzimă ce, în baza condiţiilor metodei, eliberează pe minut o anumită cantitate din grupele hidroxiaril care, atunci când intră în contact cu reactivul Folin-Ciocalteu, are o densitate optică corespunzătoare celei la care un umol de tirozina reacţionează în aceeaşi manieră.

3.  Reactivi

3.1.  Acid clorhidric 0,2 N

3.2.  Acid clorhidric 0,06 N

3.3.  Acid clorhidric 0,025 N

3.4.  Soluţie 5% (w/v) de acid tricloracetic

3.5.  Soluţie de hidroxid de sodiu 0,5 N

3.6.  Reactiv Folin-Ciocalteu.

Se plasează 100 g de tungstat de sodiu (Na₂W0₄ . 2H₂O), 25 g de molibdat de sodiu (Na₂MoO₄ . 2H₂O) şi 700 ml de apă într-o retortă cu fundul rotund de 2 litri echipată cu o îmbinare standard de sticlă mată. Se adaugă 50 ml de acid fosforic (d:1,71) şi 100 ml de acid clorhidric concentrat (d: 1,19), se conectează un condensator de reflux la retortă, se aduce la fierbere şi se ţine soluţia fierbând uşor timp de 10 ore. Se lasă să se răcească, se detaşează condensatorul de reflux, se adaugă 175 g de sulfat de litiu (Li₂SO₄ . 2H₂O), 50 ml de apă şi 1 ml de bromură. Se fierbe timp de 15 minute pentru a se elimina excesul de bromură.

Se lasă să se răcească, se transferă soluţia într-o retortă gradată de un litru, se aduce la volum cu apă, se omogenizează şi se filtrează. Nu trebuie să rămână nicio coloraţie verzuie. Inainte de utilizare se diluează un volum de reactiv cu două volume de apă.

3.7.  Soluţie de hemoglobina

Se cântăreşte o cantitate de hemoglobina (aproximativ 2 g de substrat proteic determinat în conformitate cu Anson) ce corespunde la 354 mg de azot(1) şi se plasează într-o retortă de 200 ml echipată cu o îmbinare standard de sticlă mată.

Se adaugă câţiva ml de acid clorhidric (pct. 3.2), se conectează retorta la pompa de vacuum şi se agită până când hemoglobina a fost dizolvată complet. Se eliberează vacuumul şi se adaugă, în timp ce se agită, acid clorhidric (pct. 3.2), se completează până la 100 ml. Se prepară imediat înainte de utilizare.

3.8.  Soluţie standard de tirozina

Se dizolvă 181,2 mg de tirozina în acid clorhidric (pct. 3.1) şi se completează până la un litru cu acelaşi acid (soluţie Stick). Se iau 20 ml şi se diluează până la 100 ml cu acid clorhidric (pct. 3.1). 1 ml din această soluţie conţine 0,2 umoli de tirozina.

4. Aparatură

4.1.  Baie de apă fixată la 25°C ± 0,1 °C prin ultratermostat

4.2.  Spectrofotometru

4.3.  Cronometru, acurateţe: o secundă

4.4.   Ph-metru.

5.  Procedură

5.1.   Prepararea soluţiei (vezi observaţia de la pct. 7.1) Se dizolvă 150 mg de pepsină în  100 ml de acid clorhidric (pct. 3.2). Se pipetează 2 ml din soluţie într-o retortă gradată de 50 ml şi se aduce la volum cu acid clorhidric (pct. 3.3). Ph-ul, controlat cu ph-metru, trebuie să fie de 1,6 ± 0,1. Se imersează retorta într-o baie de apă (pct. 4.1).

5.2.  Hidroliză

Se pipetează 5,0 ml de soluţie de hemoglobina (pct. 3.7) într-o eprubetă, se încălzeşte într-o baie de apă la 25°C (pct. 4.1), se adaugă 1 ml de soluţie de pepsină obţinută ca la pct. 5.1 şi se amestecă cu o baghetă de sticlă îngroşată la un capăt, cu aproximativ 10 mişcări înainte şi înapoi. Se lasă eprubetă într-o baie de apă la 25°C, exact 10 minute, măsurate de la adăugarea soluţiei de pepsină (trebuie să fie respectate cu stricteţe durata şi temperatura). Apoi se adaugă 10,0 ml de soluţie de acid tricloracetic (pct. 3.4), încălzită anterior la 25°C, se omogenizează şi se filtrează printr-un filtru uscat.

5.3.   Evoluţia colorării şi măsurarea densităţii optice

Se pipetează 5,0 ml de filtrat într-o retortă Erlenmeyer de 50 ml, se adaugă 10,0 ml de soluţie de hidroxid de sodiu (pct. 3.5) şi, agitându-se constant, 3 ml de reactiv Folin-Ciocalteu diluat (pct. 3.6). După 5 până la 10 minute, se determină densitatea optică a soluţiei cu spectro­fotometru la 750 nm în celule de 1 cm impermeabile.

5.4.  Test martor

Pentru fiecare determinare se efectuează un test martor, după cum urmează: Se pipetează 5 ml de soluţie de hemoglobina (pct. 3.7) într-o eprubetă, se încălzeşte într-o baie de apă la 25°C (pct. 4.1), se adaugă 10,0 ml de soluţie de acid tricloracetic (pct. 3.4) încălzită anterior la 25°C, se omogenizează, apoi se adaugă 1,0 ml de soluţie de pepsină obţinută la pct. 5.1. Se amestecă cu o baghetă de sticlă şi se lasă eprubetă în baia de apă (pct. 4.1) la 25°C pentru exact 10 minute. Se omogenizează şi se filtrează printr-un filtru uscat. Se urmează procedura indicată la pct. 5.3.

(1) Se determină conţinutul în azot prin metoda semi-micro Kjeldahl (conţinutul teoretic: 17,7% de azot).

5.5. Curba de calibrare

Se plasează 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 şi 5,0 ml alicote de soluţie standard de tirozină (pct. 3.8), corespunzând la 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 şi 1,0 umoli de tirozină respectiv, în retorte Erlenmeyer de 50 ml. Se încheie seriile cu o soluţie de referinţă liberă de tirozină. Se aduce la volum până la 5 ml cu acid clorhidric (pct. 3.1). Se adaugă 10,0 ml de soluţie de hidroxid de sodiu (pct. 3.5) şi, agitându-se constant, 3 ml de diluţie de reactiv Folin-Ciocalteu (pct. 3.6). Se măsoară densitatea optică, aşa cum s-a indicat la ultima propoziţie a pct. 5.3. Se trasează curba de calibrare prin schiţarea densităţilor optice corelate cu cantităţile de tirozină.

6. Calcularea rezultatelor

De pe curba de calibrare se citeşte cantitatea de tirozină în umoli ce corespunde densităţii optice a soluţiei colorate, corectată pe baza valorii martor.

Activitatea pepsinei, în umoli de tirozină la 25°C per mg şi per minut, se calculează utilizându-se formula:

Unitati per mg (U/mg) = 0,32a

                                                    P

unde:

a = cantitatea de tirozină în umoli ce se citeşte de pe curba de calibrare;

P = greutatea în mg a cantităţii de pepsină adăugată la pct. 5.2.

7. Observaţii

7.1.   Cantitatea de pepsină ce trebuie dizolvată trebuie să fie astfel încât, la măsurarea fotometrică finală, să fie obţinută o densitate optică de 0,35 ± 0,035.

7.2.  Două unităţi per mg, obţinute prin această metodă, corespund la: 3,64 miliunităţi Anson/mg (umoli de tirozină/mg min. la 35,5°C) sau 36.400 unităţi comerciale/g (umoli de tirozină/g în 10 min. la 35,5°C).

V. DETERMINAREA DE GOSIPOL LIBER

1. Scop şi domeniu de aplicare

Această metodă se utilizează pentru determinarea nivelurilor de gosipol liber, de gosipol total şi de substanţe chimic legate de acesta din sămânţă de bumbac, făină de sămânţă de bumbac şi brichete de sămânţă de bumbac şi din furaje combinate ce conţin aceste substanţe, atunci când sunt prezente în cantitate mai mare de 20 ppm.

2.  Principiu

Gosipolul trebuie extras în prezenţa 3-aminopropan-1-ol, fie cu un amestec de propan-2-ol şi hexan, pentru determinarea gosipolului liber, sau cu dimetilformamidă, pentru determinarea gosipolului total. Gosipolul este convertit de anilină în gosipol-dianilină, a cărei densitate optică este măsurată la lungimea de undă de 440 nm.

3.  Reactivi

3.1.  Amestec de propan-2-olhexan: se amestecă 60 de părţi de volum de propan-2-ol A.R. cu 40 de părţi de volum de n-hexan.

3.2.   Solvent A: se plasează într-o retortă gradată de 1 litru aproximativ 500 ml de amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1), 2 ml de aminopropan-1-ol, 8 ml de acid acetic glacial şi 50 ml de apă. Se aduce la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1). Acest reactiv este stabil timp de o săptămână.

3.3.  Solvent B: se pipetează 2 ml de 3-aminopropan-1-ol şi 10 ml de acid acetic glacial într-o retortă gradată de 100 ml. Se răceşte la temperatura camerei şi se aduce la volum cu N, N-dimetilformamidă. Acest reactiv este stabil timp de o săptămână.

3.4.   Anilină A.R.: Dacă densitatea optică a testului martor depăşeşte 0,022, se distilează anilină peste praf de zinc, aruncând prima şi ultima fracţiune de 10% a distilatului. Refrigerat şi depozitat într-o retortă maro cu dop de sticlă, acest reactiv se va ţine timp de câteva luni.

3.5.   Soluţie standard A de gosipol: Se plasează 27,9 mg de acetat de gosipol într-o retortă gradată de 250 ml. Se dizolvă şi se aduce la volum cu solvent A (pct. 3.2). Se pipetează 50 ml din această soluţie într-o retortă gradată de 250 ml şi se aduce la volum cu solvent A. Concentraţia în gosipol a acestei soluţii este de 0,02 mg per ml. Se lasă să stea timp de o oră la temperatura camerei înainte de utilizare.

3.6.   Soluţie B standard de gosipol: Se plasează 27,9 mg de acetat de gosipol într-o retortă gradată de 50 ml. Se dizolvă şi se aduce la volum cu solvent B (pct. 3.3). Concentraţia de gosipol a acestei soluţii este de 0,5 mg per ml.

Soluţiile standard A şi B de gosipol vor rămâne stabile timp de 24 de ore, dacă au fost ferite de lumină.

4. Aparatură

4.1.  Mixer (cu pahar): aproximativ 35 rpm.

4.2.  Spectrofotometru.

5.  Procedură

5.1.  Probă-test

Cantitatea de probă-test utilizată depinde de conţinutul estimat de gosipol al probei. Este preferabil să se lucreze cu o probă-test mică şi cu o parte relativ mare de alicotă a filtratului, astfel încât să se obţină suficient gosipol, pentru ca să fie posibilă măsurarea fotometrică precisă. Pentru determinarea de gosipol liber din sămânţă de bumbac, făină de sămânţă de bumbac şi din brichetele de sămânţă de bumbac, proba-test nu trebuie să depăşească 1 g. Pentru furaje combinate, aceasta poate fi de maximum 5 g. O parte de alicotă de 10 ml din filtrat este corespunzătoare în majoritatea cazurilor. Aceasta trebuie să conţină 50 până la 100 ug de gosipol. Pentru determinarea gosipolului total, proba-test trebuie să fie între 0,5 şi 5 g, pentru ca o parte de 2 ml de alicotă din filtrat să conţină 40 până la 200 ug de gosipol.

Analiza trebuie să fie efectuată la o temperatură a camerei de aproximativ 20°C.

5.2.  Determinarea de gosipol liber

Se plasează proba-test într-o retortă cu gât strâmt de 250 ml, fundul retortei fiind acoperit cu sticlă pisată. Utilizându-se o pipetă, se adaugă 50 ml de solvent A (pct. 3.2), se astupă retorta şi se amestecă timp de o oră cu mixerul. Se filtrează printr-un filtru uscat şi se colectează filtratul într-o retortă cu gâtul strâmt. Se acoperă pâlnia în timpul filtrării cu o sticlă de ceas. Se pipetează părţi identice de alicotă din filtrat ce conţine 50 până la 100 ug de gosipol în fiecare din cele două retorte gradate de 25 ml (A şi B). Dacă este necesar, se aduce la volum până la 10 ml cu solventul A (pct. 3.2). Apoi se aduce la volum conţinutul retortei (A) cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1). Această soluţie este utilizată ca soluţie de referinţă faţă de care se măsoară soluţia probei.

Se pipetează 10 ml de solvent A (pct. 3.2) în fiecare dintre celelalte două retorte gradate de 25 ml (C şi D). Se aduce la volum conţinutul retortei (C) cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1). Această soluţie este utilizată ca soluţie de referinţă faţă de care se măsoară soluţia testului martor.

Se adaugă 2 ml de anilină (pct. 3.4) în fiecare dintre retorte (D) şi (B). Se încălzeşte timp de 30 de minute deasupra unei băi de apă fierbinte, pentru a dezvolta culoarea. Se răceşte la temperatura camerei, se aduce la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1), se omogenizează şi se lasă să stea timp de o oră.

Se determină densitatea optică a soluţiei testului martor (D) prin comparare cu soluţia de referinţă (C) şi densitatea optică a soluţiei probei (B) prin comparare cu soluţia de referinţă (A), cu spectrofotometru la o lungime de undă de 440 nm, utilizându-se celule de sticlă de 1 cm.

Se scade densitatea optică a soluţiei testului martor din cea a soluţiei probei (= densitatea optică corectată). Din această valoare se calculează conţinutul în gosipol liber, aşa cum   s-a indicat la pct. 6.

5.3. Determinarea gosipolului total

Se plasează o probă-test ce conţine 1 până la 5 mg de gosipol într-o retortă gradată de 50 ml şi se adaugă 10 ml de solvent B (pct. 3.3). In acelaşi timp, se prepară un test martor, plasând 10 ml de solvent B (pct. 3.3) în altă retortă gradată de 50 ml. Se încălzesc cele două retorte timp de 30 de minute deasupra unei băi de apă fierbinte. Se răceşte la temperatura camerei şi se aduce la volum conţinutul fiecărei retorte cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1), se omogenizează şi se lasă să sedimenteze timp de 10 până la 15 minute, apoi se filtrează şi se colectează filtratele în retorte de sticlă mată cu gât strâmt.

Se pipetează 2 ml de filtrat al probei în fiecare dintre cele două retorte gradate de 25 ml şi încă 2 ml de filtrat al probei martor în fiecare dintre alte două retorte de 25 ml. Se aduce la volum conţinutul unei retorte din fiecare serie până la 25 ml, cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1). Aceste soluţii sunt utilizate ca soluţii de referinţă.

Se adaugă 2 ml de anilină (pct. 3.4) în fiecare dintre cele două retorte. Se încălzeşte timp de 30 de minute deasupra unei băi de apă fierbinte, pentru a dezvolta culoarea. Se răceşte la temperatura camerei, se aduce la volumul de 25ml cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1), se omogenizează şi se lasă să sedimenteze timp de o oră.

Se determină densitatea optică, aşa cum s-a indicat la pct. 5.2 pentru gosipolul liber. Din această valoare se calculează conţinutul de gosipol liber, aşa cum s-a indicat la pct. 6.

6. Calcularea rezultatelor

Rezultatele pot fi calculate fie pornindu-se de la densitatea optică specifică (pct. 6.1), fie prin referire la o curbă de calibrare (pct. 6.2).

6.1. Utilizarea densităţii optice specifice

Densităţile optice specifice, în baza condiţiilor descrise, sunt următoarele:

gosipol liber:  E _1%  = 625

                        1cm

gosipol total: E _1%  = 600

                       1cm

Conţinutul de gosipol liber şi total al probei este calculat după următoarea formulă:

unde:

E = densitatea optică corectată, determinată aşa cum s-a indicat la pct. 5.2;

p = proba-test, în g;

a = parte de alicotă a filtratului, în ml;

6.2.  Utilizarea curbei de calibrare

6.2.1.  Gosipol liber

Se prepară două serii de cinci retorte gradate de 25 ml. Se pipetează alicote de 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 şi 10,0 de soluţie standard A de gosipol (pct. 3.5) în fiecare serie de retorte. Se aduce la volum până la 10 ml cu solvent A (pct. 3.2). Se completează fiecare serie cu o retortă gradată de 25 ml care conţine numai 10 ml de solvent A (pct. 3.2) (test martor).

Se aduc la volum retortele din primele serii (incluzând retorta pentru testul martor) până la 25 ml cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1) (serii de referinţă).

Se adaugă 2 ml de anilină (pct. 3.4) pentru fiecare retortă din a doua serie (incluzând retorta pentru testul blanc). Se încălzeşte timp de 30 de minute într-o baie de apă fierbinte pentru a dezvolta culoarea. Se răceşte la temperatura camerei, se aduce la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1), se omogenizează şi se lasă să stea timp de o oră (serii standard).

Densitatea optică a soluţiilor din seriile standard se determină, aşa cum s-a indicat la pct. 5.2, prin comparare cu soluţiile corespunzătoare din seriile de referinţă. Se trasează curba de calibrare prin schiţarea densităţii optice în raport cu cantităţile de gosipol (în ug).

6.2.2.  Gosipol total

Se prepară 6 retorte gradate de 50 ml. In prima retortă se plasează 10 ml de solvent B (pct. 3.3), iar în celelalte se plasează respectiv 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 şi 10,0 ml de soluţie standard B de gosipol (pct. 3.6). Se umple conţinutul fiecărei retorte până la 10 ml cu solvent B (pct. 3.3). Se încălzeşte timp de 30 de minute într-o baie de apă fierbinte. Se răceşte la temperatura camerei, se umple volumul cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1) şi se omogenizează.

Se plasează 2,0 ml din aceste soluţii în fiecare dintre cele două serii de 6 retorte gradate de 25 ml. Se umple conţinutul retortelor din prima serie până la 25 ml cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1) (serii de referinţă).

Se adaugă 2 ml de anilină (pct. 3.4) în fiecare retortă dintre cele două serii. Se încălzeşte timp de 30 de minute într-o baie cu apă fierbinte. Se răceşte la temperatura camerei, se aduce la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1), se omogenizează şi se lasă să stea timp de o oră (serii standard).

Se determină densitatea optică a soluţiilor din seriile standard, aşa cum s-a indicat la pct. 5.2, prin comparare cu soluţiile corespunzătoare din seriile de referinţă. Se trasează curba de calibrare prin schiţarea densităţii optice în raport cu cantităţile de gosipol (în ug).

6.3.   Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele celor două determinări paralele efectuate pe aceeaşi probă trebuie să fie de maximum:

a)   15%, în valoare absolută, pentru conţinut de gosipol mai mic de 500 ppm;

b)   75 ppm, în valoare absolută, pentru conţinut de gosipol de minimum 500 ppm şi maximum 750 ppm;

c)   10%, în valoare absolută, pentru conţinut de gosipol mai mare de 750 ppm.

ANEXA Nr. 2 la norma sanitară veterinară

I. DETERMINAREA TILOZINEI

- prin difuziune pe agar -

1.  Scop şi domeniu de aplicare

Această metodă se utilizează pentru determinarea conţinutului de tilozină din furaje, concentrate şi premixuri, atunci când este prezentă în cantitate mai mare de 2 ppm.

2.  Principiu

Proba trebuie tratată cu o soluţie tampon fosfat la pH 8, încălzită anterior la 80°C şi apoi extrasă cu metanol. După centrifugare, extrasul trebuie diluat şi determinată activitatea antibiotică a acestuia prin măsurarea difuziei tilozinei pe mediu de agar însămânţat cu Sarcina Iutea. Difuzia este evidenţiată prin formarea de zone de inhibiţie în prezenţa microorganismului. Diametrul acestor zone este direct proporţional cu logaritmul concentraţiei de antibiotic.

3.  Microorganism: Sarcina Iutea ATCC nr. 9341

3.1.  Intreţinerea tulpinii parentale

Se inoculează cu Sarcina Iutea un tub de agar înclinat prelevat din mediul de cultură (pct. 4.1), se ajustează până la pH 7,0. Se incubează peste noapte la aproximativ 35°C. Se ţine cultura într-un refrigerator şi se reinoculează agarul înclinat cu aceasta în fiecare lună.

3.2.   Prepararea suspensiei bacteriene

Se colectează bacteriile dintr-o eprubetă cu agar înclinat, recent preparată (pct. 3.1), utilizându-se 2 până la 3 ml de soluţie fiziologică salină (pct. 4.4). Cu această suspensie se însămânţează o retortă Roux ce conţine 250 ml mediu de cultură (pct. 4.1), ajustat la pH 7,0. Se incubează timp de 24 de ore, la 35°C, apoi se colectează bacteriile în 25 ml de ser fiziologic (pct. 4.4). Se omogenizează şi se diluează această suspensie pentru a se obţine o transmisie a luminii de aproximativ 75% la 650 nm.

Această soluţie poate fi utilizată timp de o săptămână, dacă a fost ţinută într-un refrigerator.

Prin teste preliminarii pe plăcuţe cu mediu primar pentru determinare (pct. 4.1) se stabileşte cantitatea de inocul care, pentru diferite concentraţii de tilozină utilizate, va induce cele mai mari zone de inhibiţie posibile ce sunt încă clare. Mediul de cultură este inoculat la temperaturi între 48 până la 50°C.

4.  Medii de cultură şi reactivi

4.1.  Mediu primar  pentru determinare (1)

Glucoza                                                            1 g

Peptonă triptică                                               10 g

Extract de carne                                             1,5 g

Extract de drojdie                                             3 g

Agar, conform cu calitatea              10 până la 20 g

Apă distilată                                 până la 1.000 ml

Se ajustează pH-ul la 7, imediat înainte de utilizare, pentru  a se întreţine tulpina parentală şi  prepararea suspensiei de bacterii şi la pH 8 pentru determinare.

4.2.  Soluţie tampon fosfat, pH 8

Fosfat de potasiu dehidrogenat               0,523 g KH₂PO₄ A.R.

Fosfat de dipotasiu hidrogenat                16,730 g K₂HPO₄ A.R.

Apă distilată                                               până la 1.000 ml

4.3.  Soluţie tampon fosfat, pH 7

Fosfat de potasiu dehidrogenat               5,5 g KH₂PO₄ A.R.

Fosfat de dipotasiu hidrogenat                13,6 g K₂HPO₄ A.R.

Apă distilată                                               până la 1.000 ml

4.4.  Ser fiziologic steril.

4.5.  Metanol pur.

4.6.  Metanol 40% (v/v)

4.7.   Amestec de soluţie tampon fosfat (pct. 4.2)/ metanol pur: 60/40 ca volum.

4.8.  Substanţă standard: tilozină cu activitate cunoscută.

5. Soluţii standard

Se usucă substanţa standard (pct. 4.8) timp de 3 ore la 60°C într-un cuptor cu vacuum (5 mm de mercur). Se cântăresc 10 până la 50 mg într-o retortă gradată, se dizolvă în 5 ml de metanol (pct. 4.5) şi se diluează soluţia cu soluţie tampon fosfat, pH 7 (pct. 4.3), pentru a se obţine o concentraţie de tilozină bază de 1.000 ug per ml.

Se prepară din această soluţie de stoc o soluţie standard de lucru S₈ ce conţine 2 ug per ml de tilozină bază prin diluare cu amestecul (pct. 4.7).

Se prepară apoi prin diluţii succesive (1+1), utilizându-se amestecul (pct. 4.7), următoarele concentraţii:

S₄                                          1 ug/ml

S₂                                          0,5 ug/ml

S₁                                           0,25 ug/ml

6.  Extracţie

Pentru concentrate, se ia o probă-test de 10 g; pentru premixuri şi furaje, o probă test de 20 g. Se adaugă 60 ml de soluţie tampon fosfat, pH 8 (pct. 4.2), încălzită anterior până la 80°C, şi se omogenizează timp de două minute (cu mixer domestic, Ultra-turrax etc).

Se lasă să sedimenteze timp de 10 minute, se adaugă 40 ml de metanol (pct. 4.5) şi se omogenizează timp de 5 minute. Se centrifughează extractul şi se diluează o parte alicotă cu amestecul (pct. 4.7), pentru a se obţine o concentraţie prezumtivă de tilozină de 2 ug per ml (= U₈). Se prepară apoi concentraţiile U₄, U₂ şi U₁ prin diluţii succesive (1 +1), utilizându-se amestecul (pct. 4.7).

Pentru un conţinut mai mic de 10 ppm, se evaporă extractul până se usucă, într-un evaporator rotativ la 35°C, şi se dizolvă reziduul în metanol 40% (pct. 4.6).

7.  Metodă de determinare

7.1.  Inocularea mediului de cultură

Se inoculează mediul primar pentru determinare, la 48 până la 50°C (pct. 4.1), se ajustează până la pH 8,0, cu suspensie de bacterii (pct. 3.2).

7.2.  Prepararea plăcilor

Difuzia în agar este efectuată pe plăci, utilizându-se 4 concentraţii de soluţii standard (S₈ S₄, S₂, S₁) şi 4 concentraţii ale extractului (U₈ U₄, U₂ U₁). Cele 4 concentraţii ale soluţiei standard şi ale extractului trebuie să fie plasate în fiecare placă.

De aceea, se aleg tăvi ce sunt destul de mari pentru a permite ca cel puţin 8 godeuri cu diametrul de 10 până la 13 mm să fie realizate în mediu de agar. Se calculează necesarul de mediu de cultură de inoculat (pct. 7.1) pentru a se furniza o acoperire uniformă de aproximativ 2 mm grosime. Testul trebuie să fie efectuat, de preferinţă, pe plăci ce constau din plăci plate de sticlă, echipate cu un inel din aluminiu sau plastic perfectat la nivel, cu diametrul de 200 mm şi înalt de 20 mm.

Se pipetează în godeuri cantităţile măsurate cu acurateţe între 0,1 şi 0,15 ml de soluţie antibiotică, depinzând de diametrul godeurilor.

Pentru fiecare probă se repetă difuzia de cel puţin 4 ori cu fiecare concentraţie, în aşa fel încât fiecare determinare să cuprindă o evaluare de 32 de zone de inhibiţie.

7.3. Incubare

Se incubează tăvile peste noapte, la 35 până la 37°C.

8.  Evaluare

Se măsoară diametrul zonelor de inhibiţie, de preferinţă prin proiectare. Se înregistrează măsurătorile pe hârtie semilogaritmică, împărţind logaritmul concentraţiilor la diametrul zonelor de inhibiţie. Se urmăresc liniile soluţiei standard şi ale extractului. Cele două linii sunt paralele, cu condiţia să nu existe nicio interferenţă.

Logaritmul activităţii relative este calculat utilizându-se următoarea formulă:

(U₁ + U₂ + U₄+U₈ - S₁ - S₂ - S₄ - S₈ ) x 0,602

         U₄+U₈+S₄+S₈ - U₁ - U₂ - S₁ - S₂

Activitate reală = activitate prezumată x activitate relativă.

9.  Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele, efectuate pe aceeaşi probă, nu trebuie să depăşească 10% în valoare relativă.

II. DETERMINAREA VIRGINIAMICINEI

- prin difuziune pe un mediu de agar -

1. Scop şi domeniu de aplicare

Metoda se utilizează pentru determinarea virginiamicinei din furaje şi premixuri. Limita cea mai joasă de determinare este 2 mg/kg (2 ppm)(1).

2.  Principiu

Proba trebuie extrasă cu o soluţie metanolică de Tween 80. Extractul este decantat sau centrifugat şi diluat. Activitatea antibiotică a acestuia se determină prin măsurarea difuziei virginiamicinei într-un mediu de agar inoculat cu Micrococcus Iuteus. Difuzia este relevată prin formarea de zone de inhibiţie ale microorganismului. Diametrul acestor zone este estimat a fi direct proporţional cu logaritmul concentraţiei de antibiotic peste limita concentraţiilor de antibiotic utilizate.

3.  Microorganism: Micrococcus Iuteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)

3.1.  Intreţinerea culturii stoc

Se inoculează eprubete ce conţin medii de cultură înclinate (pct. 4.1) cu Micrococcus Iuteus şi se incubează timp de 24 de ore la 30°C. Se păstrează cultura într-un refrigerator, la aproximativ 4°C. Se reinoculează la fiecare două săptămâni.

3.2.  Prepararea suspensiei bacteriene(a)

Se recoltează creşterea bacteriană dintr-un agar înclinat, recent preparat (pct. 3.1) cu 2 până la 3 ml de soluţie de clorură de sodiu (pct. 4.3). Se utilizează această suspensie pentru a se inocula 250 ml de cultură de mediu (pct. 4.1) conţinută într-o retortă Roux şi se incubează timp de 18 până la 20 de ore la 30°C. Se recoltează creşterea bacteriană în 25 ml de soluţie de clorură de sodiu (pct. 4.3) şi se amestecă. Se diluează suspensia până la 1/10 cu soluţie de clorură de sodiu (pct. 4.3). Transmisia de lumină a suspensiei trebuie să fie de aproximativ 75%, măsurată la 650 nm, într-o celulă de 1 cm, faţă de soluţie de clorură de sodiu. Această suspensie poate fi păstrată timp de o săptămână, la aproximativ 4°C.

4.  Medii de cultură şi reactivi

4.1.  Mediu de cultură şi de  probă(b)

Peptonă de carne                                        6 g

Triptonă                                                      4 g

Extract de drojdie                                       3 g

Extract de carne                                       1,5 g

Glucoza                                                      1 g

Agar                                        10 până la 20 g

Apă                                         1.000 ml pH 6,5 (după stilizare).

4.2.   Fosfat tampon, pH 6

Fosfat acid de potasiu, KpHPO.                 2g

Fosfat diacid de potasiu, KH₂PO₄               8g

Apă până la                                       1.000 ml

4.3.  Soluţie de clorură de sodiu 0,8% (w/v): se dizolvă 8 g de clorură de sodiu în apă şi   se diluează până la 1.000 ml, apoi se sterilizează.

4.4.  Metanol

4.5.   Amestec de fosfat tampon (pct. 4.2)/metanol (pct. 4.4): 80/20 (v/v).

4.6.   Soluţie metanolică Tween 80 0,5% (w/v): se dizolvă 5 g de Tween 80 în metanol (pct. 4.4) şi se diluează cu metanol până la 1.000 ml.

4.7.   Substanţă standard: virginiamicină cu activitate cunoscută.

5. Soluţii standard

Se dizolvă o cantitate din substanţa standard cântărită cu acurateţe (pct. 4.7) în metanol (pct. 4.4) şi se diluează cu metanol (pct. 4.4), pentru a se obţine o soluţie stoc ce conţine 1.000 ug de virginiamicină per ml.

Depozitată într-o retortă astupată la 4°C, această soluţie este stabilă până la 5 zile.

Din această soluţie stoc se prepară, prin diluţie succesivă cu amestecul (pct. 4.5), următoarele soluţii:

S₈                                                      1 ug/ml;

S₄                                                      0,5 ug/ml;

S₂                                                      0,25 ug/ml;

S₁                                                      0,125 ug/ml.

6.  Prepararea extractului şi a soluţiilor de testare

6.1. Extracţie

6.1.1.  Produse cu un conţinut de virginiamicină de până la 100 mg/kg

Se cântăreşte o cantitate din probă de 50 g, se adaugă 200 ml de soluţie (pct. 4.6) şi se agită timp de 30 de minute. Se lasă să se sedimenteze sau se centrifughează, se iau 20 ml de soluţie de supernatant şi se evaporă până la aproximativ 5 ml, într-un evaporator rotativ, la o temperatură ce nu depăşeşte 40°C. Se diluează reziduul cu amestecul (pct. 4.5), pentru a se obţine un conţinut de virginiamicină estimat la 1 ug/ml (= U₈).

6.1.2.   Produse cu un conţinut de virginiamicină mai mare de 100 mg/kg

Se cântăreşte o cantitate de probă ce nu depăşeşte 10 g şi care conţine între 1-50 mg de virginiamicină, se adaugă 100 ml de soluţie (pct. 4.6) şi se agită timp de 30 de minute. Se lasă să se sedimenteze sau se centrifughează, apoi se diluează soluţia de supernatant cu amestecul (pct. 4.5), pentru a se obţine un conţinut de virginiamicină estimat de 1 ug/ml ( = U₈).

(1) 1 mg de virginiamicină este echivalent cu 1.000 de unităţi UK.

(a)  Pot fi utilizate alte metode, cu condiţia să fi fost stabilit că acestea dau suspensii bacteriene similare.

(b)  Poate fi utilizat orice mediu de cultură comercial de compoziţie similară şi care dă aceleaşi rezultate.

6.2. Soluţii de probă

Din soluţia U₈ se prepară soluţii U₄ (conţinut estimat: 0,5 ug/ml), U₂ (conţinut estimat: 0,25 ug/ml) şi U₁ (conţinut estimat: 0,125 ug/ml) prin intermediul diluţiei succesive (1+1) cu amestecul (pct. 4.5).

7. Procedura de testare

7.1.   Inocularea mediului de testare

Se inoculează mediul de testare (pct. 4.1) cu suspensie bacteriană (pct. 3.2) la aproximativ 50°C. Prin teste preliminare pe plăci cu mediu (pct. 4.1) se determină cantitatea de suspensie bacteriană necesară pentru a induce cele mai mari şi mai clare zone de inhibiţie, cu concentraţii variate de virginiamicină.

7.2.   Prepararea plăcilor

Difuzia pe agar este efectuată pe plăci cu 4 concentraţii ale soluţiei standard (S₈, S₄, S₂ şi S₁) şi cele patru concentraţii ale soluţiei de testare (U₈, U₄, U₂ şi U₁). Aceste 4 concentraţii de extract şi de standard trebuie neapărat să fie plasate în fiecare placă. In acest scop, se selectează plăci destul de mari pentru a permite realizarea a cel puţin 8 godeuri cu diametrul de 10 până la 13 mm şi de cel puţin 30 mm între centre, ce trebuie realizate în mediu de agar. Testul poate fi efectuat pe plăci ce constau din plăci plate de sticlă echipate cu un inel perfectat la nivel, din aluminiu sau plastic, cu diametrul de 200 mm şi înalt de 20 mm.

Se toarnă în plăci o cantitate de mediu (pct. 4.1), se inoculează ca la pct. 7.1, pentru a se obţine o grosime de aproximativ 2 mm (60 ml pentru o placă cu diametrul de 200 mm). Se lasă să se fixeze la o poziţie de nivel, se realizează godeurile şi se plasează în acestea volume măsurate cu exactitate de testare şi din soluţii standard (între 0,1 şi 0,15 ml per gaură, în conformitate cu diametrul). Se replică fiecare concentraţie de cel puţin 4 ori, astfel încât fiecare determinare să fie supusă unei evaluări a 32 de zone de inhibiţie.

7.3.   Incubare

Se incubează plăcile timp de 16 până la 18 ore la 30 ± 2°C.

8.  Evaluare

Se măsoară diametrul zonelor de inhibiţie cu o aproximaţie de 0,1 mm. Se înregistrează măsurătorile medii pentru fiecare concentraţie pe hârtie grafică semi-logaritmică, relevându-se logaritmul concentraţiilor în legătură cu diametrele zonelor de inhibiţie. Se schiţează liniile cele mai potrivite, atât ale soluţiei standard, cât şi ale extractului. Se determină punctul „cel mai potrivit" pentru nivelul standard cel mai scăzut (SL), utilizându-se formula:

a) SL = 7S₁+4S₂+S₄ - 2S₈

                       10

Se determină punctul „cel mai potrivit" pentru nivelul standard cel mai înalt (SH), utilizându-se formula:

b) SH = 7S₈+4S₄+S₂ - 2S₁

                       10

Se calculează în mod similar punctele „cele mai potrivite" pentru nivelul cel mai scăzut (UL) al extractului şi nivelul cel mai înalt al extractului, înlocuind U₁U₂, U₄ şi U₈ pentru S₁,S₂, S₄ şi S₈ în formula anterioară.

Se înregistrează valorile calculate SL şi SH pe aceeaşi hârtie grafică şi acestea se unesc, pentru a da linia „cea mai potrivită" pentru soluţia standard. Se înregistrează, în mod similar, UL şi UH şi acestea se unesc, pentru a da linia „cea mai potrivită" pentru extract.

Liniile trebuie să fie paralele în absenţa oricărei interferenţe. Din motive practice, liniile pot fi considerate paralele, dacă valorile (SH - SL) şi (UH - UL) nu diferă cu mai mult de 10% din valoarea medie a acestora.

Dacă liniile sunt estimate a nu fi paralele, fie U₁ şi S₁ sau U₈ şi S₈ pot fi ignorate şi SL, SH, UL şi UH calculate, utilizându-se formula alternativă, pentru a da liniile alternative „cele mai potrivite":

a') SL = 5S₁ + 2S₂ - S₄     sau SL = 5S₂ + 2S₂ - S₈

                          6                                            6

b') SH = 5S₄ + 2S₂ - S₁      sau   SH = 5S₈ + 2S₄ - S₂                                

                       6                                            6

şi în mod similar pentru UL şi UH. Trebuie să fie îndeplinite aceleaşi criterii de paralelism. Trebuie să fie notat în raportul final faptul că rezultatul a fost calculat pornindu-se de la 3 niveluri.

Atunci când liniile sunt considerate ca fiind paralele, se calculează logaritmul activităţii relative (log A) prin intermediul uneia dintre următoarele formule, depinzând dacă au fost utilizate 3 sau 4 niveluri pentru evaluarea paralelismului.

Pentru 4 niveluri:

c) Log A = (U₁+U₂+U₄+U₈ - S₁ - S₂ - S₄ - S₈) x 0,602

                          U₄+U₈+S₄+S₈ - U₁ - U₂ - S₁ - S₂

Pentru 3 niveluri:

d) Log A = (U₁+U₂+U₄ - S₁ - S₂ - S₄ ) x 0,401

                                U₄+S₄ - U₁ - S₁

sau

d') Log A = (U₂+U₄+U₈ - S₂ - S₄ - S₈) x 0,401

                                 U₈+S₈ - U₂ - S₂

Activitatea extractului de probă = activitatea standardului relevant x A

(U₈ = S₈ x A)

Dacă se constată că activitatea relativă este în afara intervalului 0,5 până la 2,0, atunci se repetă testarea, efectuându-se ajustările corespunzătoare la concentraţiile extractului sau, dacă acest lucru nu este posibil, la soluţiile standard. Atunci când activitatea relativă nu poate fi adusă în intervalul solicitat, orice rezultat obţinut trebuie să fie considerat ca aproximativ şi acesta trebuie să fie notat în raportul final.

Atunci când liniile sunt considerate ca nefiind paralele, se repetă determinarea. Dacă paralelismul nu este încă atins, determinarea trebuie să fie considerată ca nesatisfăcătoare.

Se exprimă rezultatul în miligrame de virginiamicină per kilogram de furaj.

9. Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele, efectuate pe aceeaşi probă, de acelaşi analist, trebuie să fie de maximum:

-  2 mg/kg, în valoare absolută, pentru un conţinut de virginiamicină de până la 10 mg/kg;

-   20% în relaţie cu cea mai mare valoare pentru un conţinut de 10 până la 25 mg/kg;

-    5 mg/kg, în valoare absolută, pentru un conţinut de 25 până la 50 mg/kg;

-   10% în relaţie cu cea mai mare valoare pentru un conţinut de peste 50 mg/kg.