ORDIN   Nr. 80 din  3 februarie 2003

pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind stabilirea metodelor de analiza si testare a laptelui tratat termic pentru consum uman direct*)

ACT EMIS DE: MINISTERUL AGRICULTURII, ALIMENTATIEI SI PADURILOR

ACT PUBLICAT IN: MONITORUL OFICIAL  NR. 157 bis  din 12 martie 2003

    *) Ordinul nr. 80/2003 a fost publicat in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I, nr. 157 din 12 martie 2003, si este reprodus si in acest numar bis.

    In temeiul prevederilor art. 31 alin. 1 din Legea sanitara veterinara nr. 60/1974, republicata, cu modificarile si completarile ulterioare,
    in baza Hotararii Guvernului nr. 362/2002 privind organizarea si functionarea Ministerului Agriculturii, Alimentatiei si Padurilor, cu modificarile si completarile ulterioare,
    vazand Referatul de aprobare nr. 161.943 din 29 ianuarie 2003, intocmit de Agentia Nationala Sanitara Veterinara,

    ministrul agriculturii, alimentatiei si padurilor emite urmatorul ordin:

    Art. 1
    Se aproba Norma sanitara veterinara privind stabilirea metodelor de analiza si testare a laptelui tratat termic pentru consum uman direct, prevazuta in anexa care face parte integranta din prezentul ordin.
    Art. 2
    Agentia Nationala Sanitara Veterinara, institutele centrale de profil si directiile sanitare veterinare judetene si a municipiului Bucuresti vor duce la indeplinire prevederile prezentului ordin.
    Art. 3
    Agentia Nationala Sanitara Veterinara va controla modul de indeplinire a prevederilor prezentului ordin.
    Art. 4
    La data intrarii in vigoare a prezentului ordin se abroga orice alte dispozitii contrare.
    Art. 5
    Prezentul ordin va fi publicat in Monitorul Oficial al Romaniei, Partea I, si va intra in vigoare la data de 31 decembrie 2004.

               p. Ministrul agriculturii, alimentatiei si padurilor,
                              Petre Daea,
                           secretar de stat

    ANEXA 1*)

    *) Anexa este reprodusa in facsimil.

                        NORMA SANITARA VETERINARA
privind stabilirea metodelor de analiza si testare a laptelui tratat termic pentru consum uman direct

    Art. 1
    Metodele de analiza si testare a laptelui tratat termic sunt urmatoarele:
    a) determinarea continutului de substanta uscata;
    b) determinarea continutului de grasime;
    c) determinarea continutului total de substanta uscata negrasa;
    d) determinarea continutului de proteina;
    e) determinarea greutatii specifice.
    Art. 2
    Implementarea metodelor de referinta de analiza si testare, determinarea criteriilor de credibilitate si prelevarea de probe trebuie sa fie efectuata in conformitate cu regulile stabilite la anexa nr. 1.
    Art. 3
    Metodele la care se refera art. 1 sunt stabilite in anexa nr. 2.
    Art. 4
    (1) Autoritatea veterinara centrala a Romaniei prin Ministerul Agriculturii, Alimentatiei si Padurilor va lua masurile necesare si va sanctiona, potrivit legii, orice incalcare a prevederilor prezentei norme sanitare veterinare.
    (2) Autoritatea veterinara centrala a Romaniei prin Ministerul Agriculturii, Alimentatiei si Padurilor poate modifica, completa sau abroga total sau partial prevederile prezentei norme sanitare veterinare.
    Art. 5
    Anexele nr. 1 si 2 fac parte integranta din prezenta norma sanitara veterinara.

    ANEXA 1*)
    la norma sanitara veterinara

    *) Anexa nr. 1 este reprodusa in facsimil.

    CAP. 1
    Prevederi generale

    1. Introducere
    Sunt stabilite cerinte generale privind reactivii, echipamentul, exprimarea rezultatelor, precizia metodelor de analiza precum si rapoartele de testare.
    Autoritatile veterinare competente si laboratoarele de analiza si testare responsabile cu prelevarea probelor de lapte tratat termic si testarea acestor probe trebuie sa respecte aceste cerinte.

    2. Reactivii
    A. Apa
    1. Daca nu exista o alta cerinta specifica, cand se face referire la apa, in scopul dizolvarii, diluarii sau spalarii, se foloseste apa distilata, apa deionizata sau demineralizata de o puritate cel putin echivalenta.
    2. Prin "dizolvare" sau "diluare", fara alte indicatii, se va intelege "dizolvare in apa" sau "diluare in apa".
    B. Substante chimice
    Daca nu exista o alta cerinta specifica, toate substantele chimice folosite trebuie sa aiba calitate analitica recunoscuta.

    3. Echipament
    A. Lista de echipamente
    Lista de echipamente folosite la diferitele metode de analiza si testare a laptelui tratat termic cuprinde numai echipamentele cu utilizare specializata si cele cu o specificatie particulara.
    B. Prin "balanta analitica" se intelege o balanta cu limita minima de cantarire de 0,1 mg.

    4. Exprimarea rezultatelor
    A. Rezultate
    Daca nu exista o alta specificatie, rezultatele prezentate in raportul de testare stabilit la pct. 6 din prezentul capitol, reprezinta media aritmetica a doua testari care indeplinesc criteriul de repetabilitate stabilit la pct. 5 lit. A pct. 1 din prezentul capitol, prevazut pentru fiecare metoda de analiza si testare a laptelui tratat termic. Daca criteriul de repetabilitate nu este indeplinit, testul trebuie repetat, daca este posibil, sau rezultatul trebuie declarat nul.
    B. Calculul rezultatelor
    Daca nu exista o alta specificatie, rezultatul trebuie calculat ca un procent de masa.

    5. Criterii de precizie: repetabilitate si reproductibilitate
    A. Criteriile de precizie stabilite pentru fiecare metoda de analiza si testare a laptelui tratat termic sunt definite astfel:
    1. Repetabilitatea - r - valoarea sub care se afla diferenta absoluta dintre rezultatele a doua testari unice obtinute prin aceeasi procedura, pe materiale de testare identice, in aceleasi conditii, respectiv acelasi operator, acelasi aparat, acelasi laborator si intr-un interval scurt de timp.
    2. Reproductibilitatea - R - valoarea sub care se afla diferenta absoluta dintre rezultatele a doua teste unice obtinute prin aceeasi procedura, pe materiale de testare identice, in conditii diferite, respectiv operatori diferiti, aparate diferite, laboratoare diferite si/sau la diferite intervale de timp.
    3. Daca nu exista o alta specificatie, pentru fiecare metoda de analiza si testare a laptelui tratat termic in parte, valorile pentru criteriile de repetabilitate si reproductibilitate pentru fiecare procedura reprezinta 95% din intervalele nivelului de confidenta, asa cum este definit de ISO 5725-2, editia 1986.
    4. Testele interlaboratoare si studiile necesare trebuie planificate si desfasurate conform ghidurilor internationale.

    6. Raportul de testare
    Raportul de testare trebuie sa specifice metoda de analiza folosita, precum si rezultatele obtinute. In plus, acesta trebuie sa precizeze orice detaliu al procedurii folosite care nu este specificat in metoda de analiza sau care este optional, precum si orice alte circumstante ce ar fi putut influenta rezultatele obtinute. Raportul de testare trebuie sa furnizeze toate informatiile necesare pentru identificarea completa a probei.

    CAP. 2
    Prelevarea de probe din lapte tratat termic

    1. Scopul si domeniul de aplicare
    Prezentul capitol precizeaza metoda de referinta de prelevare, transport si depozitare a probelor de lapte tratat termic destinat consumului uman direct.

    2. Generalitati
    a) Prelevarea probelor de lapte tratat termic din recipienti, se efectueaza de catre un operator calificat, instruit corespunzator inainte de preluarea activitatii de prelevare a probelor.
    b) Daca se considera necesar, autoritatile veterinare competente sau laboratorul de analiza si testare trebuie sa instruiasca personalul care preleveaza probele privind tehnicile de prelevare a probelor, pentru a se asigura ca probele sunt in conformitate si reprezentative pentru intregul lot.
    c) Daca se considera necesar, autoritatile veterinare competente sau laboratorul de analiza si testare trebuie sa instruiasca personalul care preleveaza probele privind marcarea probei pentru a se asigura identificare probei.

    3. Echipamentul pentru prelevarea probelor
    a) Echipamentul pentru prelevarea probelor trebuie sa fie confectionat din otel inoxidabil sau alte materiale corespunzatoare de o rezistenta corespunzatoare si cu o constructie corespunzatoare scopului urmarit - omogenizare, prelevare de probe, sau alte proceduri. Sondele si agitatoarele folosite la omogenizare trebuie sa aiba o suprafata suficienta pentru a produce o omogenizare adecvata a produsului dar fara a cauza dezvoltarea unui miros respingator. Cuvele de imersie trebuie sa aiba un maner solid, de o lungime suficienta pentru a face posibil sa se poata preleva o proba de la orice adancime a recipientului. Capacitatea cuvei trebuie sa fie de cel putin 50 ml.
    b) Recipientii pentru probe si dispozitivele de inchidere trebuie sa fie confectionate din sticla, metale adecvate sau material plastic.
    c) Materialele din care sunt confectionate echipamentele pentru prelevarea probelor, inclusiv recipientii si dispozitivele de inchidere, nu trebuie sa produca probei modificari ce pot afecta rezultatele examinarilor. Toate suprafetele echipamentului pentru prelevarea probelor si recipientii pentru probe, trebuie sa fie curate si uscate, netede si fara fisuri, cu colturile rotunjite.

    4. Tehnica de prelevare a probelor
    A. Generalitati
    1. Indiferent de testele ce trebuie sa fie efectuate, laptele trebuie sa fie foarte bine omogenizat inainte de prelevarea probelor, prin mijloace manuale sau mecanice.
    2. Proba trebuie sa fie prelevata imediat dupa omogenizare, atat timp cat laptele este inca agitat.
    3. Volumul probei trebuie sa fie corespunzator cerintelor de testare. Capacitatea recipientilor folositi pentru probe trebuie sa fie astfel incat acestia sa fie umpluti aproape complet cu proba, permitand astfel o omogenizare corespunzatoare a continutului, inainte de inceperea procedurilor de testare, evitandu-se spumarea in timpul transportului.
    B. Prelevarea manuala a probelor
    1. Prelevarea probelor dintr-o cantitate divizata
    Atunci cand cantitatea de lapte tratat termic din care urmeaza sa fie prelevata proba, se afla in mai multi recipienti, se recolteaza o cantitate reprezentativa din fiecare recipient si se noteaza cantitatea de lapte la care se raporteaza fiecare proba. Cu exceptia situatiei in care probele din fiecare recipient urmeaza sa fie testate individual, se amesteca parti - unitati - din aceste probe reprezentative, in volume proportionale cu cantitatea de lapte din recipientul din care a fost prelevata fiecare proba reprezentativa. Din aceste volume proportionale, dupa omogenizare, se preleveaza proba de analizat.
    2. Prelevarea probelor din recipienti mari - tancuri de depozitare, tancuri pentru transport feroviar si rutier.
    a) Omogenizarea laptelui printr-o procedura corespunzatoare, inainte de prelevarea probelor.
    Pentru a omogeniza continutul recipientilor mari sau a tancurilor de depozitare, tancurilor pentru transport feroviar si rutier, se recomanda folosirea agitarii mecanizata conform pct. b).
    Durata omogenizarii trebuie sa fie corespunzatoare perioadei de timp in care laptele a fost lasat in repaus. Trebuie sa se demonstreze ca eficienta procedurii de omogenizare aplicata in orice situatie speciala este corespunzatoare scopului analizei propuse. Criteriul eficientei omogenizarii influenteaza, in special, obtinerea de rezultate analitice similare de la probe prelevate, fie din diferite parti ale recipientului, fie de la robinetul de evacuare a acestuia, la intervale diferite pe durata descarcarii. O procedura de omogenizare a laptelui se considera eficienta daca diferenta continutului de grasime dintre doua probe, prelevate in aceste conditii, este mai mica de 0,1% .
    Dintr-un recipient mare cu robinetul de evacuare aflat in partea inferioara, exista o cantitate mica de lapte care nu este reprezentativa pentru tot continutul, chiar si dupa omogenizare. De aceea, probele se preleveaza, de preferinta, printr-o gura de vizitare. Daca probele sunt prelevate de la robinetul de evacuare, trebuie sa se scurga suficient lapte pentru a se asigura ca probele sunt reprezentative pentru tot continutul.
    b) Omogenizarea continutului din recipientii mari sau din tancurile de depozitare si tancurile pentru transport feroviar si rutier se poate efectua:
    1) cu ajutorul unui agitator mecanic care intra in constructia tancului, actionat de un motor electric;
    2) cu ajutorul unui agitator cu elice actionat de un motor electric, plasat la gura de vizitare, si agitatorul introdus in lapte;
    3) in cazul tancurilor pentru transport feroviar si rutier, prin recircularea laptelui prin conducta de transfer atasata pompelor de evacuare a tancului si introdusa prin gura de vizitare;
    4) prin aer comprimat filtrat; in acest caz, se indica o presiune si un volum minim de aer pentru prevenirea dezvoltarii mirosului de ranced.
    3. Prelevare de probe de lapte tratat termic destinat consumului uman direct, ambalat pentru vanzare cu amanuntul.
    Probele de lapte tratat termic pentru consum uman direct, ambalat pentru vanzare cu amanuntul, se preleveaza dintr-un pachet complet sigilat. Unde este posibil, probele trebuie prelevate de la nivelul masinii de ambalare sau din spatiul de racire al unitatii de tratare, cat mai curand posibil dupa prelucrare, iar pentru laptele pasteurizat, in aceeasi zi cu tratamentul termic. Probele sunt recoltate pentru fiecare tip de lapte tratat termic - pasteurizat, UHT si sterilizat - in numar corespunzator pentru analizele care vor fi efectuate, conform instructiunilor stabilite de laboratorul de analiza si testare sau de alta autoritate veterinara competenta.

    5. Identificarea probei
    Proba se marcheaza cu un cod astfel incat aceasta sa poata fi usor identificabila folosind instructiunile furnizate de laboratorul de analiza si testare sau de autoritatea veterinara competenta.

    6. Conservarea, transportul si depozitarea probelor
    a) Conform prevederilor in vigoare, instructiunile privind conditiile de conservare - substante chimice, temperatura, de transport, depozitare si timpul dintre prelevarea probei si analiza acesteia, trebuie sa fie emise de catre laboratorul de referinta in domeniu, in conformitate cu tipul de lapte si procedura de analiza ce urmeaza a fi folosita.
    b) In aceste instructiuni se va mentiona ca trebuie luate precautii pentru prevenirea expunerii la mirosuri contaminante si la lumina solara directa, pe durata transportului si a depozitarii probelor. Daca recipientul folosit pentru proba este transparent, acesta trebuie sa fie depozitat intr-un loc intunecos.

    ANEXA 2*)
    la norma sanitara veterinara

    *) Anexa nr. 2 este reprodusa in facsimil.

    CAP. 1
    Determinarea substantei uscate totale

    1. Scopul si domeniul de aplicare
    Aceasta procedura precizeaza metoda de referinta pentru determinarea continutului de substanta uscata totala a laptelui.

    2. Definitie
    Continutul de substanta uscata reprezinta masa care ramane dupa finalizarea procedurii de uscare specificata, exprimata ca un procentaj de masa.

    3. Principiu
    Principiul metodei consta in evaporarea apei dintr-o proba de testat la o temperatura de 102 +/-3 grade C intr-o etuva de uscare.

    4. Aparatura si sticlarie
    Echipament obisnuit de laborator si in special:
    a) Balanta analitica
    b) Desicator, prevazut cu un agent de deshidratare eficient - de exemplu silicagel proaspat deshidratat cu un indicator al continutului de apa.
    c) Etuva de uscare, cu ventilatie, reglata termostatic la 102 +/-3 grade C in tot spatiul de lucru.
    d) Placi cu fundul plat, cu o inaltime de 20 - 25 mm, diametru de 50 - 75 mm si confectionate dintr-un material corespunzator, prevazute cu capace etanse.
    f) Baie de apa fierbinte
    g) Omogenizator

    5. Pregatirea probei de testat
    a) Proba de lapte se aduce la temperatura de 20 - 25 grade C. Se amesteca in profunzime pentru a se asigura o distributie omogena a grasimii in proba. Se evita agitarea atat de puternica incat sa se produca spumarea laptelui sau separarea untului. Daca se constata a fi dificila dispersarea stratului de smantana, continutul se incalzeste incet intre 25 si 40 grade C, amestecand cu grija si incorporand si smantana ce adera la container. Proba se raceste rapid la 20 - 25 grade C.
    b) Dupa caz, poate fi folosit un omogenizator pentru a ajuta dispersarea grasimii.
    c) Nu se pot obtine rezultate corecte daca proba contine grasime lichida separata sau particule albe de forma neregulata ce adera la peretii containerului.

    6. Procedura
    a) Pregatirea placilor
    Se incalzeste placa cu capacul asezat langa aceasta, in etuva (4.d), reglata la 102 +/-3 grade C, timp de cel putin 30 minute. Se pune capacul pe placa si se transfera imediat in desicator (4.b.), se lasa sa se raceasca la temperatura camerei - de ex. timp de cel putin 30 minute - si se cantareste cu o precizie de 0,1 mg.
    b) Proba de testat
    Se cantaresc imediat 3 - 5 g din proba de testare pregatita, cu precizie de 0,1 mg, (5) in placa pregatita (6.a.).
    c) Determinarea:
    1. Placa se usuca in prealabil timp de 30 minute prin incalzirea acestuia in baia de apa fierbinte (4.e.).
    2. Placa se incalzeste in etuva (4.c), cu capacul alaturi, reglata la 102 +/-3 grade C, timp de doua ore. Capacul se pune pe placa si se scoate din etuva.
    3. Se lasa sa se raceasca in desicator (4.2) la temperatura camerei (ex. timp de cel putin 30 minute) si se cantareste cu o precizie de 0,1 mg.
    4. Placa cu capacul pus alaturi se incalzeste din nou in etuva. Se pune capacul pe placa si se scoate din etuva. Se lasa sa se raceasca timp de aproximativ 30 de minute in desicator si se cantareste cu precizie de 0,1 mg.
    5. Se repeta operatiunea descrisa la punctul 6.c.4 pana ce diferenta de greutate dintre doua cantariri consecutive nu depaseste 0,5 mg. Se inregistreaza greutatea cea mai scazuta.

    7. Exprimarea rezultatelor
    a) Calcul si formula
    Se calculeaza continutul total de substanta uscata ca procent de masa din:

           m_2 - m_0
    W_r = ----------- x 100
           m_1 - m_0

    unde:
    W_r = continutul total de substanta uscata in g/100 g,
    m_0 = masa, in grame, a placii si a capacului (a se vedea 6.a.)
    m_1 = masa, in grame, a placii, capacului si a probei de lucru (6.b.)
    m_2 = masa, in grame, a placii, capacului si probei uscate de testat (6.c.5).

    Valoarea obtinuta se rotunjeste cu o precizie de 0,01% (procent de masa).
    b) Precizie
    1. Repetabilitate (r): 0,10 g din totalul de substanta uscata/100 g produs.
    2. Reproductibilitate (R): 0,20 g din totalul de substanta uscata/100 g produs.

    CAP. 2
    Determinarea continutului de grasime

    1. Scopul si domeniul de aplicare
    Aceasta procedura precizeaza metoda de referinta pentru determinarea continutului de grasime din lapte crud, integral, lapte partial smantanit si lapte smantanit.

    2. Definitie
    Continutul de grasime a laptelui reprezinta toate substantele determinate prin metoda specifica. Acest continut este exprimat prin procente de masa.

    3. Principiul metodei
    Principiul metodei consta in extragerea grasimii dintr-o solutie alcoolica amoniacala din proba de lapte, cu dietil eter si eter petrol, solventii se elimina prin distilare sau evaporare si se determina masa substantei extrase solubila in eter petrol. Procedura este cunoscuta uzual ca metoda Rose-Gottileb.

    4. Reactivi
    Toti reactivii trebuie sa fie de o calitate analitica cunoscuta si sa nu lase reziduuri apreciabile atunci cand sunt supusi testului blank.
    Pentru a testa calitatea reactivilor, se efectueaza o determinare asa cum este specificat la punctul 6.c. din prezentul capitol. Se foloseste o fiola goala, un pahar de laborator sau o placa de metal (5.h) pentru cantarire, pregatite asa cum este specificat la pct. 6 lit. d) din prezentul capitol, ca o tara - pentru a se permite corectarea efectelor asupra rezultatului cantaririi, cauzate de schimbarile de conditii atmosferice. Daca reziduul corectat pentru aparenta schimbare a masei tarei este mai mare de 2,5 mg, se determina reziduul sau solventul separat, prin evaporarea a 100 ml dietil eter (4.d) si respectiv a 100 ml eter petrol (4.e). Se foloseste, de asemenea, o tara pentru cantarire. Atunci cand cantitatea de reziduu este mai mare de 2,5 mg, se elimina solventul prin intermediul distilarii sau aceasta se inlocuieste.
    Reactivii utilizati sunt:
    a) Solutia de amoniac, ce contine aproximativ 25% (m/m) de NH3. Poate fi folosita si o solutie mai concentrata de amoniac (conform pct. 6 lit. e) pct. 1 din prezentul capitol si pct. 5 lit. a) din "Apendix".).
    b) Etanol, de cel putin 94% (v/v). Poate fi folosit etanolul denaturat prin metanol, cu conditia sa fie sigur faptul ca nu sunt afectate rezultatele determinarii.
    c) Solutie de rosu de Congo si rosu crezol. Se dizolva in apa 1 g de rosu de Congo sau crezol si se dilueaza la 100 ml.

    NOTA:
    Folosirea acestei solutii ce permite ca suprafata de separatie intre solvent si stratul apos sa fie vazuta mai clar, este optionala (conform pct. 6.e.2.). Pot fi folosite si alte solutii apoase colorate, cu conditia ca acestea sa nu afecteze rezultatul determinarii.

    d) Dietil eter fara peroxizi si care nu contine mai mult de 2 mg/kg de antioxidanti si indeplineste cerintele testului blank (6.c).
    e) Eter petrol, avand orice limita de fierbere intre 30 si 60 grade C.
    f) Solvent amestec, preparat cu scurt timp inainte de folosire prin amestecarea unor volume egale de dietil eter (4.d) si eter petrol.

    5. Aparatura si sticlarie
    Atentionare: Din moment ce determinarea implica folosirea unor solventi volatili inflamabili, orice aparat electric folosit trebuie sa fie in conformitate cu legislatia referitoare la utilizarea unor astfel de solventi.
    Echipament de laborator obisnuit, in special:
    a) Balanta analitica
    b) Centrifuga, in care fiolele sau tuburile de extractie a grasimii (5.f) se pot roti la o frecventa de rotatie de 500 - 600 turatii/minut pentru a produce un camp gravitational de 80 - 90 g la capatul deschis al fiolelor sau tuburilor.

    NOTA:
    Folosirea centrifugii este optionala (6.e.5).

    c) Aparat de distilare sau evaporare, pentru a permite solventilor si etanolului sa fie distilate din fiole sau sa fie evaporate din paharele gradate si capsule (pct. 6 lit. e) pct. 12 si pct. 6 lit. e) pct. 15) la o temperatura ce nu depaseste 100 grade C.
    d) Etuva cu incalzire electrica, cu usi de ventilatie deschisa, ce poate fi reglata la o temperatura de 102 +/-3 grade C in tot spatiul de lucru. Etuva trebuie sa fie prevazuta cu un termometru corespunzator.
    e) Baie de apa ce poate fi mentinuta la o temperatura de 35 - 40 grade C.
    f) Fiole de extractie a grasimii tip Molonnier

    NOTA:
    Este, de asemenea, posibil sa se foloseasca tuburi de extractie a grasimii cu sifon sau dispozitiv de spalare dar atunci procedura este diferita si este specificat in "Apendix".
    Fiolele sau tuburile trebuie sa fie prevazute cu dopuri de sticla, dopuri de pluta de buna calitate sau alte tipuri de dopuri ce nu sunt afectate de reactivii folositi. Dopurile de pluta trebuie sa fie supuse extragerii cu dietil eter (4.d), tinute in apa la 60 grade C sau mai mult, timp de cel putin 15 minute si apoi trebuie lasate sa se raceasca in apa rece, astfel incat, in momentul folosirii, acestea sa fie impregnate.

    g) Stativ pentru mentinerea fiolelor sau tuburilor de extractie a grasimii (conform pct. 5.f).
    h) Flacon de spalare corespunzator, pentru folosire cu solvent amestec (4.f). Nu trebuie sa fie folosite flacoane de spalare din plastic.
    i) Recipiente pentru colectarea grasimii, de exemplu fiole de fierbere cu fund plat, fiole Erlenmeyer cu capacitate de 125 - 250 ml sau capsule metalice.
    Daca sunt folosite capsule metalice, acestea trebuie sa fie, de preferinta, din otel inoxidabil, trebuie sa fie cu fund plat, preferabil cu tub si trebuie sa aiba un diametru de 80 - 100 mm si o inaltime de aproximativ 50 mm.
    j) Reglator de fierbere, degresat - din portelan neporos sau carbid silicon ori granule din sticla, optional in cazul capsulelor metalice.
    k) Cilindrii de masurare, de capacitati de 5 si 25 ml.
    l) Pipete gradate de capacitate de 10 ml.
    m) Clesti confectionati din metal corespunzatori, pentru preluarea fiolelor, paharelor sau capsulelor.

    6. Procedura

    NOTA:
    Procedura alternativa ce foloseste tuburi de extractie a grasimii, cu sifon sau dispozitive de spalare a flaconului (conform notei de la punctul 5.f.) este descrisa in "Apendix".

    a) Pregatirea probei de testat
    Este necesara ajustarea temperaturii probei de laborator la aproximativ 35 - 40 grade C in 15 minute, prin intermediul unei bai de apa. Proba se amesteca complet dar cu grija, rasturnand flaconul cu proba, fara a produce spuma sau a se separa untul si se raceste rapid la aproximativ 20 grade C.
    b) Proba de testat
    Se amesteca proba de testat (6.a.) prin rasturnarea cu grija a flaconului de trei sau patru ori si se cantaresc imediat, cu o precizie de 0,1 mg, 10 - 11 g din proba de testat, direct sau prin diferenta, intr-unul dintre flacoanele de extractie (5.f).
    Proba de testat trebuie sa fie transferata, cat mai complet posibil in bulbul (mic) de extractie al fiolei.
    c) Testul blank
    Testul blank se efectueaza simultan cu determinarea, folosindu-se aceeasi procedura si aceiasi reactivi dar inlocuind proba de testat cu 10 - 11 ml de apa.
    Schimbarea in masa aparenta a recipientului de colectare a grasimii, corectat pentru schimbarea aparenta in masa a recipientului de control, nu trebuie sa fie mai mare de 2,5 mg.
    d) Pregatirea recipientului de colectare a grasimii
    Se usuca un recipient (5.i) impreuna cu putine reglatoare de fierbere (5.j) pentru a se realiza fierberea moderata pe durata eliminarii ulterioare a solventului in etuva, (5.d) timp de o ora. Se lasa vasul sa se raceasca (nu in desicator, dar protejat de praf) la temperatura camerei de cantarire. Recipientele de sticla se lasa cel putin o ora iar recipientele de metal se lasa cel putin 30 minute. Se are grija sa se evite variatiile de temperatura, se folosesc clesti pentru punerea recipientului in balanta si se cantareste cu o precizie de 0,1 mg.
    e) Determinarea
    1. Se adauga 2 ml de solutie de amoniac (4.a) sau un volum echivalent dintr-o solutie mai concentrata de amoniac si se amesteca complet cu proba de testat in bulbul mic al fiolei. Dupa adaugarea solutiei de amoniac, se are grija sa se efectueze determinarea fara intarziere.
    2. Se adauga 10 ml de etanol (4.b) si se amesteca moderat dar incomplet, permitandu-se ca de fapt continutul fiolei sa migreze inainte si inapoi intre cei doi bulbi; Se evita scurgerea lichidului catre gatul fiolei. Daca este necesar, se adauga doua picaturi de solutie de rosu de Congo sau rosu crezol (4.c).
    3. Se adauga 25 ml de dietil eter (4.d), se inchide fiola cu un dop de pluta imbibat cu apa sau un dop umezit cu apa (vezi 5.f) si se scutura fiola viguros dar nu excesiv, pentru evitarea formarii unei emulsii persistente, timp de un minut cu fiola in pozitie orizontala cu bulbul mic in sus. Periodic, se lasa ca lichidul sa se scurga din bulbul mare in bulbul mic. Daca este necesar, fiola se raceste in apa de la robinet, apoi se indeparteaza cu grija dopul si se spala aceasta si gatul fiolei cu o cantitate mica din solventul amestec (4.f) folosind dispozitivul de spalare (5.h) astfel incat solutia de spalare sa se scurga in fiola.
    4. Se adauga 25 ml de eter petrol (4.e), fiola se inchide cu dopul reumezit prin cufundare in apa si se agita moderat timp de 30 secunde, conform descrierii de la pct. 6.c.3.
    5. Fiola inchisa se centrifugheaza timp de 1 - 5 minute la o frecventa de rotatie de 500 - 600 turatii/minut (5.b). Daca nu este disponibila o centrifuga (conform notei de la pct. 5.b.) se lasa fiola inchisa pe stativ (5.g) timp de cel putin 30 minute pana ce stratul de supernatant este limpede si este clar separat de stratul apos. Daca este necesar, fiola se raceste sub jet de apa de la robinet.
    6. Se indeparteaza cu grija dopul de pluta sau dopul folosit si se clateste acesta impreuna cu fata interioara a gatului fiolei, cu o cantitate de solvent amestec (4.f), astfel incat lichidul de spalare sa se scurga in fiola. Daca suprafata de separatie este sub baza gatului fiolei, aceasta se ridica usor deasupra acestui nivel prin adaugare de apa, cu grija, in partea de jos a fiolei pentru a se facilita decantarea solventului.
    7. Tinand fiola de extractie de bulbul mic se decanteaza, cu grija, cat mai mult posibil din stratul de supernatant, in recipientul de colectare a grasimii, deja pregatit (6.d) si care in cazul fiolelor contine reglatoare de fierbere (5.j), optional in cazul capsulelor de metal, evitandu-se decantarea oricarui tip de strat apos.
    8. Se clateste partea exterioara a gatului fiolei de extractie cu o cantitate mica de solvent amestec (4.d) colectandu-se lichidul de spalare in recipientul de extractie a grasimii si avandu-se grija ca solventul amestec sa nu se scurga in afara fiolei de extractie. Daca se doreste, solventul sau o parte din solvent poate fi indepartat prin distilare sau evaporare, asa cum este descris la pct. 6.c.1.
    9. Se adauga 5 ml de etanol (4.b) la continutul fiolei de extractie, folosindu-se etanolul pentru spalarea partii interioare a gatului fiolei, asa cum este descris la punctul 6.e.2.
    10. Se efectueaza o extractie secundara prin repetarea operatiunii descrise la pct. 6.e.3. si 6.e.8. dar folosindu-se numai 15 ml de dietil eter (4.d) si 15 ml de eter petrol (4.e); eterul se foloseste pentru spalarea interiorului gatului fiolei de extractie. Daca este necesar, se ridica suprafata de separatie la mijlocul trunchiului fiolei, pentru a permite ca decantarea finala a solventului sa fie cat mai completa posibil.
    11. Se efectueaza o a treia extractie, prin repetarea ulterioara a operatiunilor descrise la pct. 6.e.3. si 6.e.8., dar folosind numai 15 ml de dietil eter (4.d) si 15 ml de eter petrol (4.e). Eterul se foloseste pentru spalarea interiorului gatului fiolei de extractie. Daca este necesar, se ridica suprafata de separatie la mijlocul trunchiului fiolei pentru a permite ca decantarea finala a solventului sa fie cat mai completa posibil.
    In cazul laptelui ecremat, a treia extractie poate fi omisa.
    12. Se indeparteaza solventii, inclusiv etanolul, din paharul gradat sau din capsula, cat mai complet posibil din fiola de distilare, prin evaporare (5.c), clatind interiorul gatului fiolei, inainte de inceperea distilarii cu o cantitate mica de solvent amestec (4.f).
    13. Se incalzeste recipientul de colectare a grasimii, (cu fiola plasata pe aceeasi parte pentru a permite degajarea vaporilor de solvent) timp de o ora, in etuva (5.d). Se indeparteaza recipientul de colectare a grasimii din etuva, se lasa sa se raceasca, nu in desicator dar protejat de praf, la temperatura camerei de cantarire (in cazul recipientelor de sticla se lasa cel putin o ora, iar pentru capsulele de metal se lasa cel putin 30 minute) si se cantareste cu o precizie de 0,1 mg.
    Nu trebuie sa se stearga recipientul imediat inainte de cantarire. Vasul se pune in balanta folosind clestii si se evita, in special, variatiile de temperatura.
    14. Se repeta operatiunile descrise la punctul 6.e.13 pana ce masa recipientului de colectare a grasimii descreste cu 0,5 mg sau mai putin sau creste, intre doua cantariri succesive. Se inregistreaza masa minima observata ca masa a recipientului de colectare a grasimii si a substantei extrase.
    15. Se adauga 15 ml de eter petrol in recipientul de colectare a grasimii pentru a se verifica daca substanta extrasa este sau nu solubila in totalitate. Se incalzeste cu grija si se agita solventul pana ce se dizolva grasimea.
    Daca substanta extrasa este total solubila in eter petrol, se obtine masa grasimii ca diferenta dintre masa finala a recipientului ce contine substanta extrasa (6.5.14) si masa initiala a acestuia (6.d).
    16. Daca substanta extrasa nu este total solubila in eter petrol sau in caz de dubiu, se extrage complet substanta din recipient, prin spalare repetata cu eter petrol cald.
    Se lasa sa se depuna orice urma de substanta insolubila si se decanteaza cu grija eter petrolul, fara a se indeparta substanta insolubila. Se repeta aceasta operatiune de inca trei ori, folosindu-se eter petrolul pentru spalarea suprafetei interioare a gatului recipientului.
    In final, se spala suprafata exterioara superioara a recipientului cu solvent amestec astfel incat solventul sa nu se imprastie in afara recipientului. Se indeparteaza urmele usoare de eter petrol din recipient, prin incalzire timp de o ora in etuva, se lasa sa se raceasca si se cantareste, asa cum este descris la pct. 6 lit. e) pct. 13 si pct. 6 lit. e) pct. 14.
    Se obtine masa grasimii, ca diferenta intre masa determinata la pct. 6 lit. e) pct. 14 si masa finala.

    7. Exprimarea rezultatelor
    a) Calcul si formula
    Continutul de grasime se calculeaza ca un procent de masa prin:

         (m_1 - m_2) - (m_3 - m_4)
    F = --------------------------- x 100
                    m_0

    unde
    F = continutul de grasime
    m_0 = masa, in grame, a probei de testat (6.b.)
    m_1 = masa, in grame, a recipientului de colectare a grasimii si a substantei extrase determinate la pct. 6.e.14.
    m_2 = masa, in grame, a recipientului de colectare a grasimii pregatit sau in cazul substantelor nedizolvabile, masa recipientului de colectare a grasimii si a reziduurilor nedizolvate determinate la pct. 6 lit. e) pct. 16.
    m_3 = masa in grame a recipientului de colectare a grasimii folosit la testele blank (6.c) si orice substanta extrasa, determinata la pct. 6 lit. e) pct. 14
    m_4 = masa in grame a recipientului pregatit pentru colectarea grasimii (6.b.) folosite la testul blank (6.c.) sau in cazul substantelor nedizolvate, masa recipientului de colectare a grasimii si reziduurile insolubile determinata la pct. 6 lit. e) pct. 16.
    Rezultatul se raporteaza cu o precizie de 0,01% .

    b) Precizia
    1. Repetabilitatea (r):
    (i) pentru laptele integral sau laptele partial ecremat: 0,02 g de grasime per 100 g produs,
    (ii) pentru laptele degresat: 0,01 g de grasime per 100 g produs.
    2. Reproductibilitatea (R):
    (i) pentru laptele integral: 0,04 g de grasime per 100 g produs,
    (ii) pentru laptele partial ecremat: 0,03 g de grasime per 100 g produs,
    (iii) pentru laptele degresat: 0,025 g de grasime per 100 g produs.

    CAP. 3
    Determinarea substantei uscate negrase

    1. Scopul si domeniul de aplicare
    Aceasta procedura precizeaza metoda de referinta pentru determinarea substantei uscate negrase din laptele tratat termic.

    2. Definitie si calcul
    Continutul de substanta uscata negrasa trebuie sa fie exprimat ca un procent de masa. Continutul de substanta uscata negrasa reprezinta diferenta dintre substanta uscata totala, conform cap. 1 din prezenta anexa, si continutul de grasime, conform cap. II din prezenta anexa.

    CAP. 4
    Determinarea continutului total de azot

    1. Scopul si domeniu de aplicare
    Aceasta procedura precizeaza metoda de referinta pentru determinarea continutului de azot total din lapte crud, lapte partial ecremat si lapte ecremat.

    2. Definitie
    Continutul total de azot al laptelui reprezinta continutul de azot, exprimat in procent de masa, determinat prin metoda specificata Kjeldahl.

    3. Principiu
    O cantitate cantarita din proba de lapte este supusa digestiei cu acid sulfuric concentrat si sulfat de potasiu si sulfat de cupru (II) ca si catalizator, pentru a transforma azotul din compusii organici in sulfat de amoniu. Amoniacul se elimina prin adaugarea solutiei de hidroxid de sodiu si apoi se distileaza si se absoarbe intr-o solutie de acid boric. Aceasta este titrata apoi cu solutie acida.

    4. Reactivi
    a) Sulfat de potasiu (K2SO4)
    b) Solutie de sulfat de cupru. Se dizolva intr-un recipient volumetric 5,0 g de sulfat de cupru pentahidrat (CuSO4, 5H2O) in apa si se aduce la 100 ml (la 20 grade C).
    c) Acid sulfuric, cel putin 98,0% (m/m) H2SO4.
    d) Solutie de hidroxid de sodiu, 47% (m/m) 704 g NaOH/l (20 grade C).

    NOTA:
    Poate fi folosita o solutie de hidroxid de sodiu cu o concentratie mai mica, de exemplu: 40% (m/m) 572 g/l, 20 grade C sau 30% (m/m) 399 g/l, 20 grade C.

    e) Solutie de acid boric. Se dizolva 40 g de acid boric (H3BO3) intr-un litru de apa calda, se lasa sa se raceasca si se pastreaza intr-o sticla din borosilicat.
    f) Solutie indicator. Se dizolva 0,01 g rosu metil, 0,02 g de albastru de bromtimol si 0,06 g verde de bromcrezol in 100 ml de etanol. Solutia se pastreaza intr-o sticla de culoare maro, inchisa, intr-un loc intunecos si rece.
    g) Solutie volumetrica
    c (1/2 H2SO4) sau c (HCl) = 0,1 mol/l standardizat cu o precizie de 0,0001 mol/l.
    h) Zaharoza fara azot.
    i) Sare de amoniu pura, ca oxalatul de amoniu (NH4)2C2O4, H2O) sau sulfatul de amoniu (NH4)2SO4.
    j) Triptofan (C11H12N2O2), fenacetin (C10H7CH2CONH2) sau lizina mono- sau dihidroclorid (C6H14N2O2 x HCl sau C6H14N2O2 x 2HCl).

    NOTA:
    Gradul de puritate a reactivilor de la pct. i) si j) trebuie sa fie de o calitate superioara fata de "calitatea analitica". Daca este posibil, trebuie sa se foloseasca o solutie de sare de amoniu certificata (i).

    5. Aparatura si sticlarie
    Echipament de laborator obisnuit si in special:
    a) Baloane Kjeldahl de 500 ml capacitate.
    b) Reglatoare de fierbere corespunzatoare, de exemplu, bile de sticla cu diametrul de aproximativ 5 mm, granule Hengar, piatra ponce.
    c) Eprubeta gradata sau pipeta automata ce depune 1,0 ml.
    d) Cilindri gradati de masurare, din sticla, cu o capacitate de 50, 100 si 250 ml.
    e) Aparat de digestie, intr-o pozitie inclinata (aproximativ 45 grade), cu incalzitor electric sau bec de gaz, ce nu incalzeste fiolele deasupra nivelului continutului acestora, cu sistem de extractie a fumului.
    f) Aparat de distilare confectionat din sticla de borosilicat, in care se poate instala balonul Kjeldahl (a.), constand intr-un cap de stropire eficient conectat la un condensator cu tuburi interne drepte si cu un tub de evacuare atasat la capatul inferior al acestuia. Tubulatura de conectare si dopul (s) trebuie sa inchida etans si preferabil sa fie din cauciuc neopren.
    g) Pipete sau pipete automate, pentru a furniza 0,10 ml.
    h) Fiole conice cu capacitate de 500 ml, gradate pana la 200 ml.
    i) Eprubete gradate cu capacitate de 50 ml, gradate la 0,1 ml si eroare maxima +/-0,05 ml.
    j) Lupe pentru citirea eprubetei (5.9).
    k) Ph-metru
    l) Eprubete gradate automate.

    6. Procedura
    a) In balonul Kjeldahl (5.a) se adauga reglatoare de fierbere (5.b) (adica trei bile de sticla), 15 g de sulfat de potasiu (4.a), 1,0 ml de solutie de sulfat de cupru (4.b), aproximativ 5 g din proba de lapte (cantarita cu o precizie de 0,001 g) si 25 ml acid sulfuric (4.c). Se foloseste acid pentru spalarea oricarei urme de solutie de sulfat de cupru, sulfat de potasiu sau lapte de pe gatul balonului si se amesteca cu grija continutul balonului.

    NOTA:
    Deoarece substantele organice consuma acidul sulfuric in timpul fierberii, se folosesc pentru digestie 30 ml de H2SO4 (4.c) in loc de 25 de ml, daca laptele contine mai mult de 5,0% (m/m) grasime. Acest lucru trebuie, de asemenea aplicat la testul blank.

    b) Fiecare balon Kjeldahl se incalzeste pe aparatul de digestie (5.e), la inceput usor, astfel incat toata spuma neagra sa ramana in balon. Atunci cand spumarea initiala a incetat si apar vapori albi abundenti, se fierbe puternic (vaporii de acid se vor condensa la jumatatea gatului balonului) pana cand nu mai raman particule negre si pana ce continutul balonului devine limpede de culoare albastru-verzui pal. Se fierbe apoi usor cel putin 1,5 ore. Se retin urmatoarele cerinte:
    (i) timpul de limpezire a substantei digerate nu trebuie sa fie mai mare de o ora, iar timpul total de digestie nu trebuie sa fie mai mic de 2,5 ore. Daca este necesar mai mult de o ora pentru limpezire, timpul total de digestie trebuie sa se prelungeasca in consecinta.
    (ii) sulfatul de potasiu adaugat favorizeaza digestia pe masura ce creste temperatura de fierbere a amestecului. Daca volumul rezidual de H2SO4 este mai mic de aproximativ 15 ml, la finalul timpului de digestie, azotul poate sa fi fost pierdut din cauza incalzirii excesive. Daca se incalzeste cu gaz, balonul se incalzeste pe un suport din material termoizolant, prevazut cu o deschidere circulara cu un diametru ce permite ca flacara libera sa atinga doar partea balonului care este mai jos de suprafata continutului de lichid (5.5).
    (iii) daca unele particule negre intra pe gatul balonului si nu sunt spalate sa intre in balon de acidul care circula in timpul stadiului initial al perioadei de fierbere puternica (aceasta poate fi facilitata de rotirea balonului), se permite ca balonul sa se raceasca suficient si se spala, cu grija, cu o cantitate minima de apa. Se continua digestia dupa aceea, asa cum este descris mai sus.
    c) Atunci cand baloanele Kjeldahl sunt racite, se adauga in fiecare dintre acestea 300 ml de apa (conform notei), astfel incat sa se spele cu grija gatul balonului si se amesteca complet continutul, asigurandu-se ca de fapt cristalele ce s-au separat sunt dizolvate. Se adauga cateva reglatoare de fierbere (5.b), pentru a se asigura o fierbere uniforma. Se adauga apoi, in fiecare balon 70 ml de solutie de hidroxid de sodiu (4.d) (conform notei), turnandu-se incet solutia pe gatul inclinat al balonului, pentru a se forma un strat pe fundul balonului. Nu trebuie sa se umezeasca capatul gatului cu solutie de hidroxid de sodiu.

    NOTA:
    Este necesar ca volumul compus din apa si solutia de hidroxid de sodiu, in total 370 ml, sa faca posibila colectarea a aproximativ 150 ml de distilat, chiar inainte de a urma fierberea neregulata ("clocotirea"). Astfel, daca se adauga un volum echivalent mai mare de solutie de hidroxid de sodiu ce este de o concentratie mai scazuta de 47% (m/m), volumul de apa adaugata trebuie sa fie, in consecinta, redus. De exemplu, daca urmeaza sa fie adaugati 85 ml de solutie de hidroxid de sodiu cu concentratie 40% (m/m) sau 125 ml de concentratie 30% (m/m), volumul de apa adaugat trebuie sa fie 285 ml sau respectiv 245 ml.

    d) Fiecare balon Kjeldahl se conecteaza imediat la un aparat de distilare (5.f). Se asigura ca varful tubului de evacuare a condensatorului sa fie scufundat in 50 ml solutie de acid boric (4.e) impreuna cu 0,20 ml (5 - 6 picaturi) de solutie de indicator (4.f), toate acestea fiind continute de un balon conic (5.h). Se roteste continutul fiecarui balon pentru a se amesteca bine si se fierbe, initial incet, pentru a se preveni spumarea excesiva. Atunci cand s-a colectat 100 - 125 ml de distilat, fiecare balon conic trebuie sa fie coborat pana ce varful tubului de evacuare a condensatorului este la aproximativ 40 mm deasupra semnului de 200 ml. Se continua fiecare distilare pana ce incepe fierberea puternica ("clocotirea"), apoi se inceteaza brusc incalzirea. Se deconecteaza fiecare balon Kjeldahl si se spala varful fiecarui tub de evacuare a condensatorului cu putina apa, colectand apa de spalare in baloanele conice. Se noteaza urmatoarele cerinte:
    (i) rata de distilare trebuie sa fie astfel incat sa se colecteze aproximativ 150 ml de distilat, pana la inceperea clocotirii, incat volumul continutului fiecarui balon conic va fi aproximativ de 200 ml.
    (ii) eficienta fiecarui condensator trebuie sa fie astfel incat temperatura continutului fiecarui balon conic sa nu depaseasca 25 grade C pe toata durata distilarii.
    e) Se titreaza fiecare distilat cu solutie volumetrica standard (4.g) pana ce pH-ul ajunge la 4,6 +/-0,1, folosindu-se un pH-metru si daca este necesar, o eprubeta gradata. Adaugarea unui indicator ajuta la faptul de a verifica daca titrarea se efectueaza corect. Se ia fiecare eprubeta gradata si se citeste cu o precizie de 0,1 ml, cu ajutorul unei lupe (5.j) evitand erorile de paralaxa.
    Titrarea poate fi efectuata numai cu indicator. Se titreaza pana ce culoarea distilatului corespunde cu cea a solutiei preparate recent, intr-un balon conic (5.g) din 150 ml de apa la care s-a adaugat 50 ml de solutie de acid boric si 0,20 ml de indicator.
    f) Se efectueaza un test blank, conform pct. 6.a. si 6.b. inclusiv, utilizandu-se 5 ml de apa distilata impreuna cu cca 0,1 g zaharoza (4.h), prin procedura inlocuirii probei de lapte.

    NOTA:
    Titrarea distilatului blank va necesita numai un volum foarte mic de solutie volumetrica standard (4.g).

    g) Se verifica, in mod regulat, acuratetea procedurii, prin folosirea a doua incercari de recuperare, urmandu-se procedura conform pct. 6.a. si 6.b.
    (i) Se verifica daca nu a avut loc vreo pierdere de azot, ca rezultat al caldurii excesive sau a scurgerilor mecanice din timpul distilarii, prin folosirea unei probe de testat de 0,15 g de oxalat sau sulfat de amoniu (4.i) cantarita cu o precizie de 0,001 g, impreuna cu 0,1 g de zaharoza (4.h).
    Procentul de azot recuperat trebuie sa fie intre 99,0 si 100,0% .
    Rezultate mai scazute sau mai ridicate vor indica greseli de procedura si/sau o concentratie neprecisa a solutiei standard (4.g).
    (ii) Se verifica faptul ca procedura de digestie este suficienta pentru a elibera tot azotul proteic, prin folosirea unei probe de testat de 0,20 g de triptofan pur, 0,35 g de fenacetina sau 0,20 g de hidroclorid de lizina (4.j.). Toate cantaririle trebuie sa se faca cu o precizie de 0,001 g. Trebuie sa fie recuperat cel putin 98 - 99% de azot.

    7. Masuri de protectie
    a) Atunci cand se lucreaza cu acid sulfuric si hidroxid de sodiu concentrat si atunci cand se manipuleaza baloane Kjeldahl, se poarta intotdeauna imbracaminte de laborator, ochelari de protectie si manusi rezistente la acizi.
    b) in timpul distilarii niciodata nu se lasa baloanele Kjeldah nesupravegheate. Din cauza posibilitatii de pericol, se opreste distilarea imediat ce continutul baloanelor "clocoteste" prea puternic. Daca fierberea persista mai mult de doua - trei minute, se coboara balonul de colectare astfel incat varful de distilare sa fie scos din lichid.

    8. Exprimarea rezultatelor
    a) Calcul si formula
    Se calculeaza continutul de azot (W_N), exprimat in grame de azot pe 100 g de produs, prin:

          1,40 (V - V_0) c
    W_N = -----------------
                 m

    W_N = continutul de azot
    V = volumul, in mililitri, al solutiei volumetrice standard de acid folosita la determinare.
    V_0 = volumul, in mililitri, al solutiei volumetrice standard de acid folosita la testul blank.
    c = concentratia, exprimata in moli/litri, al solutiei volumetrice standard de acid (4.g).
    m = masa, in grame, a probei de testat

    Rezultatul se rotunjeste cu o precizie de 0,001 g/100 g.
    b) Precizie
    1. Repetabilitate (r): 0,007 g/100 g
    2. Reproductibilitate (R): 0,015 g/100 g

    9. Proceduri modificate
    a) Se foloseste un aparat de digestie in bloc, prevazut cu baloane cilindrice in locul aparatului de digestie si a baloanelor Kjeldahl descrise la pct. 5.e. si 5.a. In acest caz, pentru a se identifica potentialele probleme, fiecare loc trebuie sa fie verificat individual (6.g).
    b) Se foloseste distilarea cu vapori in locul baloanelor incalzite direct (6.d). Atunci cand aparatul nu permite folosirea apei distilate, trebuie sa se aiba grija ca apa sa nu contina substante volatile acide sau alcaline.
    c) Poate fi folosita, in loc de 5 g, (6.a) o proba de testat de 1 g de lapte (semi-macro Kjeldahl), cu conditia ca:
    1. in fapt, cantitatea de reactivi folositi pentru digestie (6.a): H2SO4, CuSO4 x 5H2O, K2SO4 sa fie redusa in aceeasi proportie (1/5)
    2. timpul total de digestie (6.b) sa se reduca la 75 minute
    3. cantitatea de solutie de hidroxid de sodiu (6.3) sa se reduca in aceeasi proportie (1/5).
    4. trebuie sa fie folosita o solutie standard acid (4.g) de o concentratie mai scazuta (0,02 la 0,03 moli/l).

    NOTA:
    Folosirea uneia sau a mai multora dintre aceste optiuni este acceptabila numai in cazul in care valoarea repetabilitatii (8.b.1) si rezultatele celor doua teste de acuratete (6.g) sunt in concordanta cu cerintele acestei metode.

    CAP. 5
    Determinarea continutului de proteine

    1. Scopul si domeniul de aplicare
    Aceasta procedura precizeaza metoda de referinta pentru determinarea continutului de proteine din lapte tratat termic.

    2. Definitie
    Continutul de proteine reprezinta valoarea obtinuta prin multiplicarea continutului de azot total, exprimat in procente de masa, determinat conform metodei descrise la cap. IV pct. 3, cu un factor corespunzator.

    3. Calcul
    Continutul de proteine al laptelui exprimat ca procent de masa reprezinta continutul total de azot al laptelui multiplicat cu factorul 6,38.

    CAP. 6
    Determinarea masei specifice

    1. Scop si domeniu de aplicare
    Aceasta procedura precizeaza metoda de referinta pentru determinarea masei specifice a laptelui crud si integral, a laptelui ecremat partial si a laptelui ecremat, la 20 grade C.

    2. Definire
    Masa specifica a laptelui reprezinta valoarea raportul intre masa unui anumit volum de lapte la 20 grade C fata de masa aceluiasi volum de apa la 20 grade C.

    3. Principiu
    Masa specifica la 20 grade C este determinata printr-un hidrometru.

    4. Aparatura si sticlarie
    Echipament de laborator uzual si in special.
    a) Areometru (hidrometru)
    Un areometru de masa specifica este un instrument ce consta intr-un flotor de sticla ce este larg si greu la capatul inferior al acestuia. Exista o bagheta de sticla de forma cilindrica, atasat de partea superioara si de flotor si este orientata coaxial catre acesta. Partea superioara a baghetei este inchisa.
    Flotorul de sticla contine incarcatura (plumb, mercur etc.), destinata sa ajusteze masa areometrului. Bagheta include o scala gradata de la 1,025 la 1,035 g/ml.
    Areometrul trebuie sa fie verificat printr-o metoda picnometrica, folosindu-se un picnometru de o capacitate de aproximativ 100 ml, prevazut cu un termometru de precizie.
    b) Cilindri de sticla sau otel inoxidabil.
    Dimensiunile minime trebuie sa fie:
    (i) diametrul intern aproximativ 35 mm
    (ii) inaltime interna aproximativ 225 mm
    c) Baie de apa, reglata la 20 grade C +/-0,1 grade C
    d) Baie de apa, reglata la 40 grade C +/-2 grade C
    e) Termometru, gradat la 0,5 grade C

    5. Procedura
    a) Se amesteca proba prin rasturnare pentru a dispersa grasimea si pentru a se pune in baia de apa (4.d). Se lasa proba sa atinga o temperatura de 40 grade C si se mentine la temperatura aceasta timp de cinci minute. Se amesteca proba prin rasturnare cu grija pentru a se asigura ca grasimea este distribuita in mod omogen. Se raceste la 20 grade C in cea de-a doua baie de apa (4.c).
    b) Se amesteca proba prin rasturnare cu grija pentru a se evita includerea de aer. Se toarna laptele in cilindru (4.b), se tine inclinat astfel incat sa se evite formarea spumei sau a bulelor. Se foloseste o proba de lapte suficienta pentru a se asigura ca o parte din aceasta se revarsa din cilindru in momentul in care se introduce areometrul. Se scufunda cu grija areometrul in lapte si se lasa sa pluteasca liber pana ce ajunge la pozitia de echilibru. Cilindrul urmeaza a fi plasat vertical. Areometrul trebuie sa fie pozitionat in mijlocul coloanei de lichid si nu trebuie sa atinga peretii cilindrului.
    c) Atunci cand areometrul ajunge in echilibru, se citeste gradatia de la varful meniscului.
    d) Imediat dupa citirea areometrului se introduce termometrul (4.e) in proba si se citeste temperatura cu o precizie de 0,5 grade C. Temperatura nu trebuie sa varieze mai mult de +/-2 grade C de 20 grade C.

    6. Corectarea temperaturii
    Daca temperatura probei de lapte nu este exact de 20 grade C, atunci cand s-a efectuat masurarea masei specifice a acesteia, rezultatul obtinut trebuie sa fie corectat adaugand masei specifice determinate pentru fiecare grad Celsius peste 20 grade C sau scazand pentru fiecare grad sub 20 grade C valoarea 0,0002. Aceasta corectare este valabila numai daca temperatura laptelui difera cu cel mult 5 grade C de valoarea de 20 grade C.

    7. Exprimarea rezultatelor
    Metoda de calcul si formula masei specifice a probei sunt exprimate in g/ml pentru laptele ecremat la 20 grade C, conform urmatoarei formule:

     1000 x mv - MG x mv     0,92 mv (1000 - MG)
    --------------------- = ---------------------
             MG x mv            920 - MG x mv
     1000 - ---------
              0,92

    unde
    mv = masa specifica a probei citita pe areometru (5.d) in g/l
    MG = continutul de grasime al probei, in g/l
    0,92 = densitatea grasimii

    8. Precizie
    a) Repetabilitate (r): 0,0003 g/ml.
    b) Reproductibilitate (R): 0,0015 g/ml.

    "APENDIX"
    la Anexa nr. 2

    Proceduri alternative ce folosesc tuburi de extractie a grasimii cu sifon sau dispozitive de spalare

    Procedura
    1. Prepararea probei de testat - conform pct. 6 lit. a) din cap. II al anexei nr. 2
    2. Proba de testat
    Se procedeaza dupa cum este specificat la punctul 6.b. dar folosindu-se tuburi de extractie a grasimii (conform pct. 5 lit. f) din cap. II al anexei nr. 2).
    Proba de testat trebuie sa fie transferata cat mai complet posibil la fundul tuburilor de extractie.
    3. Testul blank - conform pct. 6 lit. c) din cap. II al anexei nr. 2.
    4. Pregatirea recipientului de colectare a grasimii - conform pct. 6 lit. d) din cap. II al anexei nr. 2.
    5. Determinarea
    a) Se adauga 2 ml de solutie de amoniac (pct. 4 lit. a) din cap. II al anexei nr. 2) sau un volum echivalent a unei solutii de amoniac mai concentrata si se amesteca cu proba de testat tratata in prealabil, in profunzime pe fundul tubului. Dupa adaugarea amoniacului, se efectueaza determinarea fara intarziere.
    b) Se adauga 10 ml de etanol (pct. 4 lit. b) din cap. II al anexei nr. 2) si se amesteca cu grija dar complet pe fundul tubului. Daca este de dorit, se adauga doua picaturi de solutie de rosu de Congo sau rosu crezol (pct. 4 lit. c) din cap. II al anexei nr. 2).
    c) Se adauga 25 ml de dietil eter (pct. 4 lit. d) din cap. II al anexei nr. 2), se inchide tubul cu un dop de pluta imbibat cu apa sau cu un dop umezit cu apa (pct. 5 lit. f) din cap. II al anexei nr. 2) si se agita tubul viguros dar nu excesiv, pentru a se evita formarea unei emulsii persistente, prin rasturnari repetate, timp de un minut. Daca este necesar, se lasa tubul sa se raceasca la jet de apa, apoi se indeparteaza cu grija dopul de pluta si se spala impreuna cu gatul tubului, cu o cantitate mica de solvent amestec (pct. 4 lit. f) din cap. II al anexei nr. 2) folosindu-se flaconul de spalare (pct. 5 lit. h) din cap. II al anexei nr. 2), astfel incat lichidul de spalare sa curga inapoi in tub.
    d) Se adauga 25 ml de eter petrol (pct. 4 lit. e) din cap. II al anexei nr. 2), se inchide tubul cu dopul de pluta reumezit prin scufundare in apa si se agita usor timp de 30 de secunde asa cum este descris la pct. c).
    e) Se centrifugheaza tubul inchis, timp de 1 - 5 minute, la o frecventa de rotatie de 500 - 600 de turatii/minut (pct. 5 lit. b) din cap. II al anexei nr. 2). Daca nu este disponibila centrifuga (conform pct. 5 lit. b) din cap. II al anexei nr. 2), se lasa tubul inchis pe stativ (pct. 5 lit. g) din cap. II al anexei nr. 2) pentru cel putin 30 de minute pana ce stratul supernatant se limpezeste si se separa in mod distinctiv de stratul apos. Daca este necesar, tubul se raceste la jet de apa.
    f) Se indeparteaza cu grija dopul de pluta si se spala impreuna cu gatul tubului, cu o cantitate mica de solvent amestec, astfel incat lichidul de spalare sa curga inapoi in tub.
    g) Se insera un sifon corespunzator sau un flacon de spalare ce trebuie sa intre intr-un tub si se impinge in jos marginea interioara mai lunga a instalatiei pana ce tubul de intrare este la aproximativ 3 mm deasupra interfetei dintre straturi. Marginea interioara a instalatiei trebuie sa fie paralela cu axa tubului de extractie.
    Se transfera cu grija stratul supernatant al tubului intr-un recipient de colectare a grasimii (pct. 6 lit. d) din cap. II al anexei nr. 2) ce contine cateva reglatoare de fierbere (pct. 5 lit. j) din cap. II al anexei nr. 2) in cazul fiolelor (optional la capsulele de metal), evitandu-se transferul vreunuia dintre straturile apoase. Se spala tubul de evacuare al instalatiei cu o cantitate mica de solvent amestec, colectandu-se lichidul de spalare in recipientul de colectare a grasimii.
    h) Se desface dispozitivul de la gatul tubului, se ridica usor instalatia si se ridica partea inferioara a marginii interioare mai lungi a acesteia, si se spala cu o cantitate mica de solvent amestec. Se coboara si se re-insera instalatia si se transfera lichidul de spalare in recipientul de colectare a grasimii. Se spala tubul de evacuare a instalatiei cu o cantitate mica de solvent amestec, colectandu-se lichidul de spalare in recipient. Daca este de dorit, solventul, sau o parte din solvent poate fi indepartat din recipient prin distilare sau evaporare, asa cum este descris la pct. 6 lit. e) pct. 12 din cap. II al anexei nr. 2.
    i) Se coboara din nou instalatia de la nivelul gatului, se ridica usor si se adauga la continutului tubului 5 ml de etanol, folosindu-se etanol pentru ridicarea marginii interioare mai lungi a instalatiei. Se amesteca dupa cum este descris la pct. 5 lit. b).
    j) Se efectueaza o a doua extractie prin repetarea operatiunilor descrise la pct. 5 lit. c). - pct. 5 lit. h). dar folosindu-se numai 15 ml de dietil eter (pct. 4 lit. d) din cap. II al anexei nr. 2) si 15 ml de eter petrol (pct. 4 lit. e) din cap. II al anexei nr. 2). Eterul se foloseste pentru a se spala marginea interioara mai lunga a instalatiei, in timpul indepartarii instalatiei din tub dupa extractia precedenta.
    k) Se efectueaza o a treia extractie, prin repetarea operatiunilor descrise la lit. c) - lit. h), folosindu-se 15 ml de dietil eter si 15 ml de eter petrol si se spala marginea interioara mai lunga a instalatiei, dupa cum este descris la lit. j).
    In cazul laptelui ecremat, a treia extractie poate fi omisa.
    l) Se procedeaza asa cum este descris la pct. 6 lit. e) pct. 12   pct. 6 lit. e) pct. 16 din cap. II al anexei nr. 2.