ORDIN Nr. 24
din 1 februarie 2007
privind aprobarea Normei
sanitare veterinare ce stabileste metode de analiza pentru determinarea
produselor amprolium, diclazuril si carbadox din furaje
ACT EMIS DE:
AUTORITATEA SANITARA VETERINARA SI PENTRU SIGURANTA ALIMENTE
ACT PUBLICAT IN:
MONITORUL OFICIAL NR. 138 din 26 februarie 2007
Având în vedere prevederile art. 10 lit. b) din
Ordonanţa Guvernului nr. 42/2004 privind organizarea activităţii
sanitar-veterinare şi pentru siguranţa alimentelor, aprobată cu modificări şi
completări prin Legea nr. 215/2004, cu modificările şi completările ulterioare,
în temeiul art. 3 alin. (3) şi al art. 4 alin. (3) din
Hotărârea Guvernului nr. 130/2006 privind organizarea şi funcţionarea
Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor şi a
unităţilor din subordinea acesteia,
văzând Referatul de aprobare nr. 70.064 din 23 ianuarie
2007, întocmit de Direcţia de control şi coordonare a activităţii farmaceutice
veterinare din cadrul Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru
Siguranţa Alimentelor,
preşedintele Autorităţii Naţionale Sanitare
Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor emite
următorul ordin:
Art. 1. - Se aprobă Norma sanitară veterinară ce
stabileşte metode de analiză pentru determinarea produselor amprolium,
diclazuril şi carbadox din furaje, prevăzută în anexa care face parte
integrantă din prezentul ordin.
Art. 2. - Autoritatea Naţională Sanitară Veterinară şi
pentru Siguranţa Alimentelor, institutele veterinare centrale şi direcţiile
sanitar-veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene şi a municipiului
Bucureşti vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.
Art. 3. - La data intrării în vigoare a prezentului
ordin se abrogă Ordinul preşedintelui Agenţiei Veterinare şi pentru Siguranţa
Alimentelor nr. 25/2004 pentru aprobarea Normei veterinare ce stabileşte metode
naţionale de analiză pentru
determinarea produselor amprolium, diclazuril şi carbadox din furaje, publicat
în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 şi 1.020 bis din 4 noiembrie 2004.
Art. 4. - Prezentul ordin
transpune Directiva Comisiei 1999/27/CE din 20 aprilie 1999 ce stabileşte
metode comunitare de analiză pentru determinarea produselor aprolium,
diclazuril şi carbadox din furaje, amendează directivele 71/250/CEE şi
73/46/CEE şi abrogă Directiva 74/203/CEE, publicată în Jurnalul Oficial al
Comunităţilor Europene (JOCE) nr. L 118 din 6 mai 1999, p. 36.
Art. 5. - Prezentul ordin va fi publicat în Monitorul
Oficial al României, Partea I.
Preşedintele Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor,
Marian Avram
ANEXĂ
NORMĂ SANITARĂ VETERINARĂ
ce stabileşte metode de analiză pentru determinarea
produselor amprolium, diclazuril şi carbadox din furaje
Art. 1. - Analizele pentru determinarea conţinutului în
amprolium, diclazuril şi carbadox, efectuate în vederea controalelor oficiale
ale furajelor şi ale premixurilor, trebuie să fie efectuate utilizând metodele
stabilite în anexa care face parte integrantă din prezenta normă sanitară
veterinară.
Art. 2. - Autoritatea Naţională Sanitară Veterinară şi
pentru Siguranţa Alimentelor informează Comisia Europeană cu privire la actele
normative şi prevederile administrative necesare pentru implementarea prezentei
norme sanitare veterinare.
ANEXĂ la norma sanitară veterinară
PARTEA A
Determinarea produsului amprolium
[Clorhidrat de clorură de
1-[(4-amino-2-propil-5-pirimidin)metil]-2-metil-piridinium]
1. Scop şi domeniu de aplicare
Această metodă se utilizează pentru determinarea
produsului amprolium din furaje şi premixuri. Limita de detecţie este de 1
mg/kg, iar limita de determinare este de 25 mg/kg.
2. Principiu
Proba este extrasă cu un amestec de metanol şi apă.
După diluare cu faza mobilă şi filtrare prin membrană, conţinutul în amprolium
se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC) cu schimbători de cationi,
utilizând un detector UV.
3. Reactivi
3.1. Metanol
3.2. Acetonitril, de grad HPLC
3.3. Apă, de grad HPLC
3.4. Soluţie de fosfat dihidrogenat de sodiu, c = 0,1
mol/l Se dizolvă în apă 13,80 g de fosfat dihidrogenat
de sodiu monohidrat (3.3) într-un balon gradat de
1.000 ml, se aduce la semn cu apă (3.3) şi se omogenizează.
3.5. Soluţie de perclorat de sodiu, c = 1,6 mol/l
Se dizolvă 224,74 g de perclorat de sodiu monohidrat în
apă (3.3) într-un balon gradat de 1.000 ml, se aduce la semn cu apă (3.3) şi se
omogenizează.
3.6. Fază mobilă pentru HPLC (vezi pct. 9.1) Amestec
de acetonitril (3.2), soluţie de fosfat dihidrogenat de sodiu (3.4) şi soluţie de perclorat de sodiu (3.5),
450 + 450 + 100 (v + v + v). Inainte de utilizare se filtrează printr-un filtru
cu membrană de 0,22 µm (4.3)
şi se degazează soluţia [de exemplu, în baia cu ultrasunete (4.4) timp de cel
puţin 15 minute].
3.7. Substanţă etalon: amprolium pur, clorhidrat
clorură de 1 -[(4-amino-2-propil-5-pirimidin)metil]-2-metil-piridinium, E 750
(vezi 9.2)
3.7.1. Soluţie etalon stoc de amprolium, 500 µg/ml
Se cântăresc cu o precizie de 0,1 mg 50 mg de amprolium
(3.7) într-un balon gradat de 100 ml, se dizolvă în 80 ml de metanol (3.1) şi
se plasează balonul timp de 10 minute într-o baie cu ultrasunete (4.4). După
tratamentul cu ultrasunete, se aduce soluţia la temperatura camerei, se aduce
la semn cu apă şi se omogenizează. La o temperatură =< 4°C, soluţia este stabilă timp de o lună.
3.7.2. Soluţie etalon intermediară de amprolium, 50 µg/ml
Se pipetează 5 ml din soluţia etalon stoc (3.7.1)
într-un balon gradat de 50 ml, se aduce la semn cu solvent de extracţie (3.8)
şi se omogenizează. La o temperatură =< 4°C, soluţia este stabilă timp de o lună.
3.7.3. Soluţii de etalonare
Se transferă 0,5, 1 şi 2 ml din soluţia etalon
intermediară (3.7.2) într-o serie de baloane gradate de 50 ml. Se aduce la semn
cu faza mobilă (3.6) şi se omogenizează. Aceste soluţii corespund la 0,5, 1 şi, respectiv, 2 µg de amprolium pe ml.
Aceste soluţii trebuie să fie proaspăt preparate înainte de utilizare.
3.8. Solvent de extracţie
Amestec de metanol (3.1) şi apă 2+1 (v+v)
4. Aparatură
4.1. Echipament HPLC cu sistem de injecţie,
corespunzător injectării de volume de 100 µl
4.1.1. Coloană pentru cromatografie lichidă de 125 mm
x 4 mm cu schimbători de cationi, umplere de Nucleosil 10 SA de 10 µm sau echivalentă
4.1.2. Detector UV cu lungime de undă variabilă sau
detector cu grup de diode
4.2. Filtru cu membrană, material
PTFE, de 0,45 µm
4.3. Filtru cu membrană de 0,22 µm
4.4. Baie cu ultrasunete
4.5. Agitator mecanic sau magnetic
5. Procedură
5.1. Generalităţi
5.1.1. Furaj martor
Pentru efectuarea testului de recuperare (5.1.2) trebuie
analizat un furaj martor pentru a se verifica absenţa amproliumului sau a substanţelor
interferenţe. Furajul martor trebuie să fie de tip similar cu cel al probei şi
nu trebuie să fie detectate amprolium sau substanţe interferenţe.
5.1.2. Teste de recuperare
Trebuie efectuat un test de recuperare prin analizarea
furajului martor ce a fost îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de amprolium
similare celei prezente în probă. Pentru a obţine o concentraţie de 100 mg/kg
se transferă 10 ml din soluţia etalon stoc (3.7.1) într-un balon conic de 250
ml şi se evaporă soluţia până la aproximativ 0,5 ml. Se adaugă 50 g de furaj
martor, se amestecă cu grijă şi se lasă timp de 10 minute, amestecând din nou
de mai multe ori înainte de a continua cu faza de extracţie (5.2).
Alternativ, dacă nu este disponibil un furaj martor de
tip similar celui din probă (a se vedea 5.1.1), poate fi efectuat un test de
recuperare prin intermediul metodei de adiţie a etalonului. In acest caz, în
proba de analizat trebuie adăugată o cantitate de amprolium similară celei deja
prezente în probă. Această probă trebuie analizată împreună cu proba
neîmbogăţită, iar recuperarea poate fi calculată prin diferenţă.
5.2. Extracţie
5.2.1. Premixuri (conţinut de amprolium < 1%) şi
furaje Se cântăresc cu o precizie de 0,01 g între 5 şi 40 g de probă, în funcţie de conţinutul în
amprolium, într-un balon conic de 500 ml şi se adaugă 200 ml de solvent de
extracţie (3.8). Se plasează balonul în baia cu ultrasunete (4.4) şi se lasă
timp de 15 minute. Se scoate balonul din baia cu ultrasunete şi se agită timp
de o oră cu agitatorul mecanic sau cu agitatorul magnetic (4.5). Se diluează o
parte alicotă a extractului cu faza mobilă (3.6) pentru obţinerea unui conţinut
în amprolium de 0,5-2 µg/ml şi
se amestecă (vezi observaţia 9.3). Se filtrează 5 - 10 ml din această soluţie
diluată printr-un filtru cu membrană (4.2). Se continuă cu determinarea HPLC
(5.3).
5.2.2. Premixuri (conţinut 1% amprolium)
Se cântăresc cu o precizie de 0,001 g 1-4 g de premix,
în funcţie de conţinutul în amprolium, într-un balon conic de 500 ml şi se
adaugă 200 ml de solvent de extracţie (3.8). Se plasează balonul în baia cu
ultrasunete (4.4) şi se lasă timp de 15 minute. Se scoate balonul din baia cu
ultrasunete şi se agită timp de o oră cu agitatorul mecanic sau cu agitatorul
magnetic (4.5). Se diluează o parte alicotă a extractului cu faza mobilă (3.6)
pentru obţinerea unui conţinut în amprolium de 0,5-2 µg/ml şi se amestecă. Se filtrează 5-10 ml din această soluţie
diluată printr-un filtru cu membrană (4.2). Se continuă cu determinarea HPLC
(5.3).
5.3. Determinarea HPLC
5.3.1. Parametri:
Sunt oferite pentru orientare următoarele condiţii; pot
fi utilizate alte condiţii
numai dacă acestea dau rezultate echivalente:
Coloană cromatografică lichidă (4.1.1): 125 mm x 4 mm, cu schimbători de
cationi,umplere de Nucleosil 10 SA de 10 µm sau echivalentă
Fază mobilă (3.6): Amestec de
acetonitril (3.2), soluţie de fosfat dihidrogenat de sodiu (3.4) şi soluţie de
perclorat de sodiu (3.5), 450+450+100 (v+v+v)
Debit: 0,7-1 ml/min
Lungimea undei de detecţie: 264
nm
Volum de
injecţie: 100 µl
Stabilitatea sistemului cromatografic se verifică prin
injectarea de mai multe ori a soluţiei de etalonare (3.7.3) conţinând 1,0 µg/ml, până la obţinerea de înălţimi ale
picului şi timpi de retenţie constanţi.
5.3.2. Curbă de etalonare
Fiecare soluţie de etalonare (3.7.3) se injectează de
mai multe ori şi se determină înălţimile (ariile) medii ale picului pentru
fiecare concentraţie. Se stabileşte o curbă de etalonare utilizând înălţimile
(ariile) medii ale picului ale soluţiilor de etalonare ca ordonate şi
concentraţiile corespondente, în µg/ml, ca abcise.
5.3.3. Soluţia probei
Se injectează extractul din probă (5.2) de mai multe
ori, utilizând acelaşi volum ca cel utilizat pentru soluţiile de etalonare, şi
se determină înălţimea (aria) medie a picului pentru amprolium.
6. Calculul rezultatelor
Concentraţia soluţiei probei în µg/ml, prin referire la curba de etalonare
(5.3.2), se determină plecând de la înălţimea (aria) medie a picurilor pentru
amprolium a soluţiei din probă.
Conţinutul probei în amprolium w, exprimat în mg/kg, se
determină prin utilizarea următoarei formule:
w=Vxβxf [mg/kg],
m
în care:
V = volumul solventului de
extracţie (3.8) în ml,conform 5.2 (adică 200 ml);
β =
concentraţia de amprolium din extractul din probă (5.2), în g/ml;
f = factorul de diluţie
conform 5.2;
m = masa porţiunii de test,
în g.
7. Validarea rezultatelor
7.1. Identitate
Identitatea substanţei de analizat poate fi confirmată
prin cocromatografie sau utilizând un detector cu grup de diode, prin
intermediul căruia sunt comparate spectrele extractului probei (5.2) şi ale
soluţiei de etalonare (3.7.3) conţinând 2,0 µg/ml.
7.1.1. Cocromatografie
Un extract din probă (5.2) este îmbogăţit prin
adăugarea unei cantităţi corespunzătoare din soluţia de etalonare (3.7.3).
Cantitatea de amprolium adăugată trebuie să fie similară cantităţii de amprolium constatate în extractul probei.
Numai înălţimea picului de amprolium ar trebui să
crească după luarea în considerare atât a cantităţii adăugate, cât şi a diluţiei extractului.
Lărgimea picului, la jumătatea înălţimii sale, trebuie să se situeze la ± 10%
din lărgimea iniţială a picului de amprolium al extractului probei
neîmbogăţite.
7.1.2. Detecţie cu grupuri de diode
Rezultatele sunt evaluate în conformitate cu
următoarele criterii:
a) lungimea de undă a absorbţiei maxime a spectrelor
probei şi a etalonului, înregistrată la vârful picului pe cromatogramă, trebuie
să fie aceeaşi într-o marjă determinată de puterea de rezoluţie a sistemului de
detecţie. Pentru detecţia cu grupuri de diode, aceasta este în general de ± 2
nm;
b) între 210 şi 320 nm, spectrele probei şi ale
etalonului, înregistrate la vârful picului cromatogramei, trebuie să fie
identice pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi 100% din
absorbanta relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt prezente
aceleaşi maxime, iar deviaţia dintre cele două spectre nu depăşeşte 15% în
niciun punct observat din absorbanta substanţei etalon de analizat;
c) între 210 şi 320 nm, spectrele curbei ascendente,
ale vârfului şi ale curbei descendente a picului produse de extractul din probă
trebuie să fie identice pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi
100% din absorbanta relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt
prezente aceleaşi maxime şi când la toate punctele observate deviaţia dintre
spectre este de maximum 15% din absorbanta spectrului vârfului picului.
Prezenţa substanţei de analizat este confirmată doar dacă criteriile de la lit.
a), b) şi c) sunt îndeplinite.
7.2. Repetabilitate
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări
paralele efectuate pe aceeaşi probă trebuie să fie de maximum:
a) 15% din valoarea superioară, pentru un conţinut în
amprolium între 25 mg/kg şi 500 mg/kg;
b) 75 mg/kg pentru un conţinut în amprolium între 500
mg/kg şi 1.000 mg/kg;
c) 7,5% din valoarea superioară,
pentru un conţinut în amprolium mai mare de 1.000 mg/kg.
7.3. Recuperare
Pentru o probă (martor) îmbogăţită, recuperarea trebuie
să fie de cel puţin 90%.
8. Rezultatele unui studiu de colaborare
(interlaboratoare)
A fost organizat un studiu de colaborare, în cursul căruia au fost analizate 3 furaje pentru păsări
(probele 1 -3), un furaj mineral (proba 4) şi un premix (proba 5).
Rezultatele sunt prezentate în următorul tabel:
|
|
Proba 1 (furaj martor)
|
Proba 2
|
Proba 3
|
Proba 4
|
Proba 5
|
|
L
|
14
|
14
|
14
|
14
|
15
|
|
n
|
56
|
56
|
56
|
56
|
60
|
|
medie (mg/kg)
|
-
|
45,5
|
188
|
5.129
|
25.140
|
|
sr (mg/kg)
|
-
|
2,26
|
3,57
|
178
|
550
|
|
CVr (%)
|
-
|
4,95
|
1,90
|
3,46
|
2,20
|
|
sR (mg/kg) CVR (%)
|
-
|
2,95
|
11,8
|
266
|
760
|
|
CVR[%]
|
-
|
6,47
|
6,27
|
5,19
|
3,00
|
|
Conţinut nominal (mg/kg)
|
-
|
50
|
200
|
5.000
|
25.000
|
|
L: număr de laboratoare
n: număr de valori unice
sr: deviaţie standard a
repetabilităţii
CVr: coeficient de variaţie
a repetabilităţii
SR: deviaţie standard a
reproductibilităţii
CVR: coeficient de variaţie a
reproductibilităţii
|
9. Observaţii
9.1. Dacă proba conţine
tiamină, picul tiaminei din cromatogramă apare puţin înainte de picul
amproliumului. Potrivit acestei metode, amproliumul şi tiamina trebuie să fie
separate. Dacă amproliumul şi tiamina nu sunt separate de coloana (4.1.1)
utilizată în această metodă, se înlocuieşte cu metanol până la 50% din partea
de acetonitril a fazei mobile (3.6).
9.2. Conform Farmacopeii britanice, spectrul soluţiei
de amprolium (c = 0,02 mol/l) în acid clorhidric (c = 0,1 mol/l) prezintă
maxime la 246 nm şi 262 nm. Absorbanta va fi de 0,84 la 246 nm şi de 0,80 la
262 nm.
9.3. Extractul trebuie să fie întotdeauna diluat în
timpul fazei mobile, pentru a împiedica schimbarea semnificativă a timpului de
retenţie al picului amproliumului datorită schimbărilor din forţa ionică.
PARTEA B
Determinarea diclazurilului
(+)-4-clorfenil [2,6 diclor-4-
(2,3,4,5-tetrahidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2yl) fenil]-acetonitril
1. Scop şi domeniu de aplicare
Metoda se utilizează pentru determinarea diclazurilului
din furaje şi premixuri. Limita de detecţie este de 0,1 mg/kg, iar limita de
determinare este de 0,5 mg/kg.
2. Principiu
După adiţia unui etalon intern, proba trebuie extrasă
cu metanol acidifiat. Pentru furaje, o parte alicotă a extractului este
purificată pe un cartuş C18 pentru extracţie în fază solidă. Diclazurilul este
eluat din cartuş cu un amestec de metanol acidifiat şi apă. După evaporare,
reziduul este dizolvat în DMF/apă. Pentru premixuri, extractul trebuie evaporat,
iar reziduul trebuie dizolvat în DMF/apă. Conţinutul în diclazuril se determină
prin cromatografie în fază lichidă de înaltă performanţă (HPLC) cu gradient
ternar şi în fază inversă, prin utilizarea unui detector UV.
3. Reactivi
3.1. Apă, de grad HPLC
3.2. Acetat de amoniu
3.3. Hidrogenosulfat de tetrabutilamoniu (TBHS)
3.4. Acetonitril, de grad HPLC
3.5. Metanol, de grad HPLC
3.6. N, N-dimetilformamidă (DMF)
3.7. Acid clorhidric, ρ20 = 1,19 g/ml
3.8. Substanţă etalon: diclazuril ((11)-24: [2,6 dicloro-(4-clorofenil)-4-(2,
3, 4, 5-tetrahidro-3,5-dioxo-1, 2, 4-triazin-2-yl) fenil]-acetonitril, cu
puritate garantată, E771
3.8.1. Soluţie etalon stoc de diclazuril, 500 µg/ml
Se cântăresc cu o precizie de 0,1 mg 25 mg de substanţă
etalon de diclazuril (3.8) într-un balon gradat de 50 ml. Se dizolvă în DMF
(3.6), se aduce la semn cu DMF (3.6) şi se omogenizează. Se împachetează
balonul într-o foaie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare brună şi
se depozitează în frigider. La o temperatură =<4°C, soluţia este stabilă timp de o lună.
3.8.2. Soluţie etalon de
diclazuril, 50 µg/ml
Se transferă 5,00 ml din soluţia etalon stoc (3.8.1)
într-un balon gradat de 50 ml, se aduce la semn cu DMF (3.6) şi se
omogenizează. Se împachetează balonul într-o folie de aluminiu sau se
utilizează un balon de culoare brună şi se depozitează în frigider. La o
temperatură =<4°C, soluţia
este stabilă timp de o lună.
3.9. Substanţă etalon internă: 2,6
dicloro-a-[4-chlorofenil]-4-[4,5dihidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazină-2 (3H)-yl]
a-metilbenzen-acetonitril
3.9.1. Soluţie etalon stoc internă, 500 µg/ml
Se cântăresc cu o precizie de 0,1 ml 25 mg de substanţă
etalon internă (3.9) într-un balon gradat de 50 ml. Se dizolvă în DMF (3.6), se
aduce la semn cu DMF (3.6) şi se omogenizează. Se împachetează balonul într-o
folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare brună şi se depozitează
în frigider. La o temperatură =<4°C, soluţia este stabilă timp de o lună.
3.9.2. Soluţie etalon internă, 50 µg/ml. Se transferă 5,00 ml din soluţia
etalon stoc internă (3.9.1) într-un balon gradat de 50 ml, se aduce la semn cu
DMF (3.6) şi se omogenizează. Se împachetează flaconul într-o folie de aluminiu
sau se utilizează un balon de culoare brună şi se depozitează în frigider. La o
temperatură =<4°C, soluţia
este stabilă timp de o lună.
3.9.3. Soluţie etalon internă pentru premixuri,
p/1.000 mg/ml (p = conţinut nominal în diclazuril al premixului în mg/kg). Se
cântăresc cu o precizie de 0,1 mg 10 mg de substanţă etalon internă într-un
balon gradat de 100 ml, se dizolvă în DMF (3.6) într-o baie cu ultrasunete
(4.6), se aduce la semn cu DMF şi se omogenizează. Se împachetează flaconul
într-o folie de aluminiu sau se utilizează un flacon de culoare brună şi se
depozitează în frigider. La o temperatură =<4°C, soluţia este stabilă timp de o lună.
3.10. Soluţie de etalonare, 2 µg/ml
Se pipetează 2,00 ml de soluţie etalon de diclazuril
(3.8.2) şi 2,00 ml de soluţie etalon internă (3.9.2) într-un balon gradat de 50
ml. Se adaugă 16 ml de DMF (3.6), se aduce la semn cu apă şi se omogenizează.
Această soluţie trebuie să fie proaspăt preparată înainte de utilizare.
3.11. Cartuş C 18 pentru extracţie în fază solidă, de
exemplu, Bond Elut, mărime: 1 cc, masă de sorbţie: 100 mg
3.12. Solvent de extracţie: metanol acidifiat
Se pipetează 5,0 ml de acid clorhidric (3.7) în 1.000
ml de metanol (3.5) şi se omogenizează.
3.13. Fază mobilă pentru HPLC
Solvent A: acetat de amoniu - soluţie de
hidrogenosulfat de tetrabutilamoniu.
3.13.1. Se dizolvă 5 g de acetat de amoniu (3.2) şi
3,4 g de TBHS (3.3) în 1.000 ml de apă (3.1) şi se omogenizează.
3.13.2. Solvent B: acetonitril (3.4)
3.13.3. Solvent C: metanol (3.5)
4. Aparatură
4.1. Agitator mecanic
4.2. Echipament pentru HPLC cu gradient ternar
4.2.1. Coloană pentru cromatografie lichidă, umplere de Hypersil ODS de 3 µm, 100 mm x 4,6 mm sau echivalent.
4.2.2. Detector UV cu lungime de undă variabilă sau
detector cu grup de diode
4.3. Evaporator rotativ în vid
4.4. Filtru cu membrană de 0,45 µm
4.5. Distribuitor în vid
4.6. Baie cu ultrasunete
5. Procedură
5.1. Generalităţi
5.1.1. Furaj martor
Absenţa diclazurilului şi a substanţei interferenţe se
verifică prin analiza unui furaj martor. Furajul martor trebuie să fie de tip
similar cu proba şi la analiză nu trebuie să fie detectate diclazuril sau
substanţe interferenţe.
5.1.2. Test de recuperare
Testul de recuperare se efectuează prin analizarea
furajului martor ce a fost îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de
diclazuril similare celei prezente în probă. Pentru obţinerea unei concentraţii
de 1 mg/kg se adaugă 0,1 ml din soluţia etalon stoc (3.8.1) la 50 g dintr-un
furaj martor, se amestecă cu
grijă şi se lasă timp de 10 minute, amestecând din nou de mai multe ori înainte
de procedeul de extracţie (5.2).
Alternativ, dacă un furaj martor de tip similar probei
nu este disponibil (vezi 5.1.1), poate fi efectuat un test de recuperare prin
intermediul metodei de adiţie a etalonului. In acest caz, proba ce urmează să
fie analizată trebuie îmbogăţită cu o cantitate de diclazuril similară celei
deja prezente în probă. Această probă se analizează alături de proba
neîmbogăţită, iar recuperarea se calculează prin diferenţă.
5.2. Extracţie
5.2.1. Furaje
Se cântăresc cu o precizie de 0,01 g aproximativ 50 g
din probă. Se transferă într-un balon conic de 500 ml, se adaugă 1,00 ml din
soluţia etalon internă (3.9.2), 200 ml solvent de extracţie (3.12) şi se astupă
balonul. Se agită amestecul cu agitatorul (4.1) pe parcursul nopţii. Se lasă să
se depună timp de 10 minute. Se transferă o parte alicotă de 20 ml din
supernatant într-un recipient de sticlă corespunzător şi se diluează cu 20 ml
de apă. Se transferă această soluţie într-un cartuş de extracţie (3.11) şi se
trece prin vid (4.5). Se spală cartuşul cu 25 ml dintr-un amestec de solvent de
extracţie (3.12) şi apă, 65 + 35 (V + V). Se elimină fracţiunile colectate şi se eluează compuşii cu 25 ml
dintr-un amestec de solvent de extracţie (3.12) şi apă, 80 + 20 (V + V). Se evaporă această fracţiune până când aceasta ajunge la sec, prin
intermediul evaporatorului rotativ (4.3) la 60°C. Se dizolvă reziduul în 1,0 ml
de DMF (3.6), se adaugă 1,5 ml de apă (3.1) şi se amestecă. Se filtrează
printr-un filtru cu membrană (4.4). Se continuă cu determinarea HPLC (5.3).
5.2.2. Premixuri
Se cântăreşte cu o precizie de 0,001 g aproximativ 1 g
din probă. Se transferă într-un balon conic de 500 ml, se adaugă 1,00 ml din
soluţia etalon internă (3.9.3), 200 ml de solvent de extracţie (3.2), şi se
astupă balonul. Se agită amestecul pe parcursul nopţii cu agitatorul (4.1). Se
lasă să se depună timp de 10 minute. Se transferă o parte alicotă de 10000/p ml
(p = conţinut nominal în diclazuril al premixului în mg/kg) din supenatant
într-un balon cu fundul rotund de mărime adecvată. Se evaporă până când acesta
ajunge la sec, sub presiune redusă la 60°C, prin intermediul evaporatorului
rotativ (4.3). Se redizolvă reziduul în 10,0 ml de DMF (3.6), se adaugă 15,0 ml
de apă (3.1) şi se omogenizează. Se continuă cu determinarea HPLC (5.3).
5.3. Determinarea HPLC
5.3.1. Parametri
Sunt oferite spre orientare următoarele condiţii; pot
fi utilizate alte condiţii numai dacă acestea dau rezultate echivalente.
Coloană cromatografică lichidă (4.2.1) 100 mm x 4,6
mm, umplere de Hypersil ODS de 3 µm sau echivalent
Fază mobilă:
Solvent A (3.13.1): Soluţie
apoasă de acetat de amoniu şi hidrogenosulfat de tetrabutilamoniu
Solvent B (3.13.2): acetonitril
Solvent C (3.13.3): metanol
Mod de eluţie:
- gradient linear
- condiţii iniţiale: A+B+C = 60+20+20
(v+v+v)
- după 10 minute, eluţia prin gradient
timp de 30 de minute la A+B+C = 45+20+35 (v+v+v)
Se clăteşte cu B timp de 10 minute.
Debit:
1,5-2 ml/min
Volum de injecţie: 20 µl
Lungimea undei de detecţie: 280 µl
Stabilitatea sistemului
cromatografie se verifică prin injectarea de mai multe ori a soluţiei de
etalonare (3.10), conţinând 2 µg/ml, până când sunt obţinute înălţimi ale picului şi timpi de
retenţie constanţi.
5.3.2. Soluţie de etalonare
Inălţimea (zona) medie a picului de diclazuril şi
picurile etalonului intern se determină prin injectarea a 20 µl din soluţia de etalonare (3.10) de mai
multe ori.
5.3.3. Soluţia din probă
Inălţimea (zona) medie a picului de diclazuril şi
picurile etalonului intern se determină prin injectarea a 20 µl din soluţia din probă (5.2.1 sau 5.2.2)
de mai multe ori.
6. Calculul rezultatelor
6.1. Furaje
Conţinutul probei în diclazuril w (mg/kg) se determină
prin utilizarea următoarei formule:
w = hd,s x hi,c
x δd,c x 10V [mg/kg],
hi,s x hd,c
m
unde:
hd,s = înălţimea
(aria) picului de diclazuril în soluţia de probă (5.2.1);
hi,s = înălţimea
(aria) picului etalonului intern în soluţia de probă (5.2.1);
hd,c = înălţimea
(aria) picului de diclazuril în soluţia de etalonare
(3.10);
hi,c = înălţimea
(aria) picului etalonului intern în soluţia de etalonare
(3.10);
δd,c = concentraţia diclazurilului în soluţia de etalonare în µg/ml (3.10);
m = masa porţiunii de test în g;
V = volumul extractului probei conform 5.2.1 (de
exemplu 2,5 ml).
6.2. Premixuri
Conţinutul în diclazuril w (mg/kg) din probă se
determină prin utilizarea următoarei formule:
w = hd,s x hi,c
x δd,c x 0,02 Vp
[mg/kg],
hi,s x hd,c
m
unde:
hd,c = înălţimea
(aria) picului de diclazuril în soluţia de etalonare
(3.10);
hi,c = înălţimea
(aria) picului etalonului intern în soluţia de
etalonare (3.10);
hd,s = înălţimea
(aria) picului de diclazuril în soluţia probei (5.2.2);
hi,s = înălţimea
(aria) picului etalonului intern în soluţia probei
(5.2.2);
δd,c = concentraţia diclazurilului în soluţia de etalonare
(3.10);
m = masa porţiunii de test în g;
V = volumul extractului probei conform 5.2.2 (de
ex. 25 ml);
p = conţinutul nominal de diclazuril în mg/kg din premix.
7. Validarea rezultatelor
7.1. Identitate
Identitatea substanţei de analizat poate fi confirmată
prin cocromatografie sau prin utilizarea unui detector cu grup de diode prin
care sunt comparate spectrele extractului din probă (5.2.1 sau 5.2.2) şi ale
soluţiei de etalonare (3.10).
7.1.1. Cocromatografie
Un extract din probă (5.2.1 sau 5.2.2) este îmbogăţit
prin adăugarea unei cantităţi corespunzătoare din soluţia de etalonare (3.10).
Cantitatea de diclazuril adăugată trebuie să fie similară cu cantitatea de
diclazuril constatată în extractul din probă.
Numai înălţimea picului de diclazuril şi a picului
etalonului intern ar trebui să crească după luarea în considerare atât a
cantităţii adăugate, cât şi a diluţiei extractului. Lărgimea picului, la
jumătatea înălţimii sale, trebuie să se situeze la ± 10% din lărgimea iniţială
a picului de diclazuril sau a picului etalonului intern al extractului din
proba neîmbogăţită.
7.1.2. Detectare cu grup de diode
Rezultatele sunt evaluate în conformitate cu
următoarele criterii:
a) lungimea de undă de absorbţie maximă a spectrelor
probei şi a etalonului, înregistrate la vârful picului pe cromatogramă, trebuie
să fie aceeaşi, cu o marjă stabilită de puterea de rezoluţie a sistemului de
detecţie. Pentru detecţia cu grup de diode, aceasta este în general de ± 2 nm;
b) între 230 şi 320 nm, spectrele probei şi ale
etalonului, înregistrate la vârful picului cromatogramei, trebuie să fie
identice pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi 100% din absorbanta relativă. Acest criteriu
este îndeplinit atunci când sunt prezente aceleaşi maxime, iar deviaţia dintre
cele două spectre nu depăşeşte 15% în niciun punct observat din absorbanta
substanţei etalon de analizat;
c) între 230 şi 320 nm, spectrele curbei ascendente,
ale vârfului şi ale curbei descendente ale picului produse de extractul probei
trebuie să fie aceleaşi pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi
100% din absorbanta relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt
prezente aceleaşi maxime şi când la toate punctele observate deviaţia între
spectre este de maximum 15% din absorbanta spectrului
vârful picului.
Prezenţa substanţei de analizat este confirmată doar
dacă toate celelalte 3 criterii (a, b şi c) sunt îndeplinite.
7.2. Repetabilitate
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări
paralele efectuate pe aceeaşi probă trebuie să fie de maximum:
a) 30% din valoarea superioară, pentru un conţinut în
diclazuril situat între 0,5 şi 2,5 mg/kg;
b) 0,75 mg/kg pentru un conţinut în diclazuril situat
între 2,5 şi 5 mg/kg;
c) 15% din valoarea superioară, pentru un conţinut în
diclazuril mai mare de 5 mg/kg.
7.3. Recuperare
Pentru o probă (martor) îmbogăţită, recuperarea trebuie
să fie de cel puţin 80%.
8. Rezultatele unui studiu de colaborare
A fost organizat un studiu de colaborare în care au fost
analizate 5 probe de către 11 laboratoare. Aceste
probe au constat în două premixuri; unul a fost amestecat cu o matrice organică
(O 100) şi celălalt cu o matrice anorganică (A 100). Conţinutul teoretic este
de 100 mg de diclazuril pe kg. Cele 3 furaje amestecate pentru păsări au fost
fabricate de 3 producători diferiţi (NL) (LI/ZI/KI). Conţinutul teoretic este
de 1 mg de diclazuril pe kg. Laboratoarele au fost instruite să analizeze
fiecare dintre probe o singură dată sau în dublu. (Informaţii mai detaliate cu
privire la acest studiu de colaborare pot fi găsite în Jurnalul AOAC
Internaţional, volumul 77, nr. 6, 1994, pag. 1359-1361.)
Rezultatele sunt date în tabelul următor:
|
|
Proba 1
A 100
|
Proba 2
O 100
|
Proba 3
L 1
|
Proba 4
Z 1
|
Proba 5
K 1
|
|
L
|
11
|
11
|
11
|
11
|
6
|
|
n
|
19
|
18
|
19
|
19
|
12
|
|
Medie
|
100,8
|
103,5
|
0,89
|
1,15
|
0,89
|
|
Sr (mg/kg)
|
5,88
|
7,64
|
0,15
|
0,02
|
0,03
|
|
CVr (%)
|
5,83
|
7,38
|
17,32
|
1,92
|
3,34
|
|
SR (mg/kg)
|
7,59
|
7,64
|
0,17
|
0,11
|
0,12
|
|
CVR (%)
|
7,53
|
7,38
|
18,61
|
9,67
|
13,65
|
|
Conţinutul nominal (mg/kg)
|
100
|
100
|
1
|
1
|
1
|
|
L: număr de laboratoare
n: număr de valori unice
sr: deviaţie standard a
repetabilităţii
CVr: coeficient de variaţie
a repetabilităţii
SR: deviaţie standard a
reproductibilităţii
CVR: coeficient de variaţie a
reproductibilităţii
|
9. Observaţii
Răspunsul diclazurilului trebuie să fi fost demonstrat
în prealabil ca fiind linear peste gama de concentraţii ce sunt măsurate.
PARTEA C
Determinarea carbadoxului
Metil 3-(2-quinoxalinilmetilenă)carbazat N1 ,N4-dioxid
1. Scop şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă se utilizează pentru determinarea
carbadoxului din furaje, premixuri şi preparate. Limita de detecţie este de 1
mg/kg. Limita de determinare este de 10 mg/kg.
2. Principiu
Proba se echilibrează cu apă şi se extrage cu
metanol-acetonitril. Pentru furaje, o parte alicotă a extractului filtrat
trebuie supusă purificării pe o coloană de oxid de aluminiu. Pentru premixuri
şi preparate, o parte alicotă a extractului filtrat trebuie diluată la o
concentraţie corespunzătoare cu apă, metanol şi acetonitril. Conţinutul în
carbadox se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC)
în fază inversă, utilizând un detector cu UV.
3. Reactivi
3.1. Metanol
3.2. Acetonitril, de grad HPLC
3.3. Acid acetic, w = 100%
3.4. Oxid de aluminiu: neutru, grad de activitate I
3.5. Metanol-acetonitril 1 +1 (v + v)
Se amestecă 500 ml de metanol (3.1) cu 500 ml de acetonitril
(3.2)
3.6. Acid acetic, σ = 10%
Se diluează 10 ml de acid acetic (3.3) cu apă până la
100 ml
3.7. Acetat de sodiu, CH3COONa
3.8. Apă, de grad HPLC
3.9. Soluţie tampon de acetat, c = 0,01 mol/l, pH =
6,0 Se dizolvă 0,82 g de acetat de sodiu (3.7) în 700 ml de apă (3.8) şi se ajustează pH-ul la 6,0
cu acid acetic (3.6). Se transferă într-un balon gradat de 1.000 ml, se aduce
la semn cu apă (3.8) şi se omogenizează.
3.10. Fază mobilă pentru HPLC
Se amestecă 825 ml de soluţie tampon de acetat (3.9) cu
175 ml de acetonitril (3.2). Se filtrează printr-un filtru de 0,22 µm (4.5) şi se degazează soluţia (de
exemplu, prin tratare cu ultrasunete timp de 10
minute).
3.11. Substanţă etalon
Carbadox pur: metil 3-(2-quinoxalinilmetilenă)carbazat
N1, N4-dioxid-E850
3.11.1. Soluţie etalon stoc de carbadox, 100 µg/ml (vezi pct. 5 Procedură):
Se cântăresc, cu o precizie de 0,1 mg, 25 mg de
substanţă etalon de carbodax (3.11) într-un balon gradat de 250 ml. Se dizolvă
în metanol-acetonitril (3.5) prin tratare cu ultrasunete (4.7). După
tratamentul cu ultrasunete se aduce soluţia la temperatura camerei, se aduce la
semn cu metanol-acetonitril (3.5) şi se omogenizează. Se ambalează balonul
într-o folie de aluminiu sau se utilizează sticlărie de culoare brună şi se
depozitează într-un frigider. La o temperatură =< 4°C, soluţia este stabilă timp de o lună.
3.11.2. Soluţii de etalonare
Se transferă 2,0, 5,0, 10,0 şi 20,0 ml din soluţia
etalon stoc (3.11.1) într-o serie de baloane gradate de 100 ml. Se adaugă 30 ml
de apă, se aduce la semn cu metanol-acetonitril (3.5) şi se omogenizeză. Se
ambalează baloanele în folii de aluminiu. Aceste soluţii corespund la 2,0, 5,0,
10,0 şi, respectiv, 20,0 µg/ml
de carbadox. Soluţiile de etalonare trebuie să fie proaspăt preparate înainte
de utilizare.
Notă: Pentru determinarea carbadoxului din furaje ce
conţin mai puţin de 10 mg/kg trebuie să se prepare soluţii de etalonare cu o
concentraţie inferioară valorii de 2,0 µg/ml.
3.12. Amestec de apă-[metanol-acetonitril] (3.5), 300 +
700 (v + v)
Se amestecă 300 ml de apă cu 700 ml din amestecul de
metanol-acetonitril (3.5).
4. Aparatură
4.1. Agitator de laborator sau magnetic
4.2. Hârtie de filtru din
fibră de sticlă (Whatman GF/A sau echivalent)
4.3. Coloană de sticlă (lungime de 300 - 400 mm,
diametru intern de aproximativ 10 mm), cu frită de sticlă sinterizată şi valvă
de evacuare
Notă: Poate fi utilizată, de asemenea, o coloană de
sticlă prevăzută cu un robinet sau o coloană de sticlă cu o extremitate
efilată; în acest caz, un tampon mic de vată de sticlă este inserat la
extremitatea inferioară şi se împinge utilizând o baghetă de sticlă.
4.4. Echipament HPCL cu sistem de injecţie, adecvat pentru injectarea de volume de 20 µl
4.4.1. Coloană pentru cromatografie lichidă: 300 mm x
4 mm, C18, umplere de 10 µm
sau echivalentă
4.4.2. Detector UV cu lungime de undă variabilă sau
detector cu grup de diode ce funcţionează între 225 şi 400 nm
4.5. Filtru cu membrană de 0,22 µm
4.6. Filtru cu membrană de 0,45 µm
4.7. Baie cu ultrasunete
5. Procedură
Notă: Carbadoxul este fotosensibil. Toate procedurile
se efectuează în lumină estompată prin utilizarea de sticlărie de culoare brună
sau sticlărie ambalată în folie de aluminiu.
5.1. Generalităţi
5.1.1. Furaj martor
Pentru efectuarea testului de recuperare (5.1.2)
trebuie să fie analizat un furaj martor, pentru a se verifica absenţa
carbadoxului şi a substanţelor interferenţe. Furajul martor trebuie să fie de
tip similar cu proba şi la analiză nu trebuie detectate nici carbadox şi nici
substanţe interferenţe.
5.1.2. Test de recuperare
Testul de recuperare se efectuează prin analizarea
furajului martor (5.1.1) ce a fost îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de
carbadox similare celei prezente în probă. Pentru obţinerea unei concentraţii
de 50 mg/kg se transferă 5,0 ml din soluţia etalon stoc (3.11.1) într-un balon
conic de 200 ml. Se evaporă soluţia de aproximativ 0,5 ml într-un curent de
azot. Se adaugă 10 g din furajul martor, se amestecă şi se aşteaptă timp de 10
minute înainte de a continua cu faza de extracţie (5.2).
Alternativ, dacă nu este disponibil un furaj martor de
tip similar probei (vezi 5.1.1), poate fi efectuat un test de recuperare prin
intermediul metodei de adiţie a etalonului, In acest caz, proba trebuie
îmbogăţită cu o cantitate de carbadox similară celei deja prezente în probă.
Această probă se analizează împreună cu proba neîmbogăţită şi recuperarea se
calculează prin diferenţă.
5.2. Extracţia
5.2.1. Furaje
Se cântăresc, cu o precizie de 0,01 g, aproximativ 10 g
din probă şi se transferă într-un balon conic de 200 ml. Se adaugă 15,0 ml de
apă, se amestecă şi se echilibrează timp de 5 minute. Se adaugă 35,0 ml de metanol- acetonitril (3.5), se
astupă şi se agită timp de 30 de minute cu agitatorul mecanic sau cu agitatorul
magnetic (4.1). Se filtrează soluţia printr-o hârtie de filtru din fibră de
sticlă (4.2). Se reţine această soluţie pentru faza de purificare (5.3).
5.2.2. Premixuri (0,1-2,0%)
Se cântăreşte, cu o precizie de 0,001 g, aproximativ 1
g din proba nemăcinată şi se transferă într-un balon conic de 200 ml. Se adaugă
15,0 ml de apă, se amestecă şi se echilibrează timp de 5 minute. Se adaugă 35,0
ml de metanol-acetonitril (3.5), se astupă şi se agită timp de 30 de minute cu
un agitator mecanic sau cu un agitator magnetic (4.1). Se filtrează soluţia
printr-o hârtie de filtru din fibră de sticlă (4.2). Se pipetează o parte
alicotă a filtratului într-un balon gradat de 50 ml. Se adaugă 15,0 ml de apă,
se aduce la semn cu metanol-acetonitril (3.5) şi se omogenizează. Concentraţia
de carbadox a soluţiei finale trebuie să fie de aproximativ 10 µg/ml. O parte alicotă este filtrată
printr-un filtru de 0,45 µm
(4.6). Se continuă cu dozarea HPLC (5.4).
5.2.3. Preparate (>2%)
Se cântăresc, cu o precizie de 0,001 g, aproximativ 0,2
g din proba nemăcinată şi se transferă într-un balon conic de 250 ml. Se adaugă
45,0 ml de apă, se amestecă şi se echilibrează timp de 5 minute. Se adaugă
105,0 ml de metanol-acetonitril (3.5), se astupă şi se omogenizează. Proba se
supune ultrasunetelor (4.7) timp de 15 minute, urmate de agitare mecanică sau
magnetică timp de 15 minute (4.1). Se filtrează soluţia printr-o hârtie de
filtru din fibră de sticlă (4.2). Se diluează o parte alicotă a filtratului cu
amestecul de apă-metanol-acetonitril (3.12), până la o concentraţie finală în
carbadox de 10-15 µg/ml
(pentru o preparare la 10%, factorul de diluţie este de 10). O parte alicotă
este filtrată printr-un filtru de 0,45 µm (4.6). Se continuă cu determinarea HPLC (5.4).
5.3. Purificare
5.3.1. Prepararea coloanei de oxid de aluminiu
Se cântăresc 4 g de oxid de aluminiu (3.4) şi se
transferă în coloana de sticlă (4.3).
5.3.2. Purificarea probei
Se aplică 15 ml din extractul filtrat (5.2.1) în
coloana de oxid de aluminiu şi se elimină primii 2 ml de eluant. Se colectează
următorii 5 ml şi se filtrează o parte alicotă printr-un filtru de 0,45 µm (4.6). Se continuă cu determinarea HPLC (5.4).
5.4. Determinarea HPLC
5.4.1. Parametri
Următoarele condiţii sunt oferite pentru orientare; pot
fi utilizate alte condiţii numai dacă acestea dau rezultate echivalente.
Coloană cromatografică lichidă (4.4.1): 300 mm x 4 mm, C18, umplere de 10 µm sau echivalentă
Fază mobilă (3.10): Amestec de soluţie tampon de acetat (3.9)
si acetonitril (3.2),825 + 175(v+v)
Debit: 1,5-2
ml/min.
Lungimea undei de detecţie: 365
nm
Volum de injecţie: 20 µl
Stabilitatea sistemului cromatografic se verifică prin
injectarea de mai multe ori a soluţiei de etalonare (3.11.2) conţinând 5,0 µg/ml, până când sunt obţinute înălţimi
(arii) ale picurilor şi timpi de retenţie constanţi.
5.4.2. Curbă de etalonare
Fiecare soluţie de etalonare (3.11.2) se injectează de
mai multe ori şi se măsoară înălţimile (ariile)
picurilor pentru fiecare concentraţie. Curba de
etalonare se stabileşte prin utilizarea înălţimilor sau ariilor medii ale
picurilor soluţiilor de etalonare ca ordonate şi a concentraţiilor
corespondente în µg/ml ca abcise.
5.4.3. Soluţia probei
Inălţimea (aria) medie a picurilor carbadoxului se
determină prin injectarea de mai multe ori a extractului probei [(5.3.2) pentru
furaje, (5.2.2) pentru premixuri şi (5.2.3) pentru preparate].
6. Calculul rezultatelor
Concentraţia soluţiei din probă în µg/ml prin referire la curba de etalonare
(5.4.2) se determină plecând de la înălţimea (aria) medie a picurilor
carbadoxului soluţiei din probă.
6.1. Furaje:
Conţinutul w în carbadox (mg/kg) din probă se determină
prin utilizarea următoarei formule:
w=δxV1 [mg/kg],
m
în care:
δ =
concentraţia de carbadox a extractului din probă (5.2.2
sau 5.2.3) în µg/ml;
V1= volumul de
extracţie în ml (adică 50 ml);
m = masa porţiunii de test în
g.
6.2. Premixuri şi preparate
Conţinutul w al probei în carbadox exprimat (mg/kg) se
determină prin utilizarea următoarei formule:
w=δxV2xf [mg/kg],
m
în care:
δ =
concentraţia de carbadox a extractului din probă (5.2.2
sau 5.2.3) în µg/ml;
V2 = volumul de
extracţie în ml (adică 50 ml pentru premixuri; 150
pentru preparate);
f = factor de diluţie
conform 5.2.2 (premixuri) sau 5.2.3 (preparate);
m = masa porţiunii de test în
g.
7. Validarea rezultatelor
7.1. Identitate
Identitatea substanţei de analizat poate fi confirmată
prin cocromatografie sau prin utilizarea unui detector cu grup de diode prin
care sunt comparate spectrele extractului din probă şi ale soluţiei de
etalonare (3.11.2) conţinând 10,0 µg/ml.
7.1.1. Cocromatografie
Un extract al probei este îmbogăţit prin adăugarea unei
cantităţi corespunzătoare de soluţie de etalonare (3.11.2). Cantitatea de
carbadox adăugat trebuie să fie similară cantităţii estimate de carbadox
constatată în extractul din probă.
Inălţimea picului carbadoxului poate să fie mărită după
luarea în considerare atât a cantităţii adăugate, cât şi a diluţiei
extractului. Lărgimea picului, la jumătatea înălţimii sale maxime, trebuie să
se situeze la ± 10% din lărgimea iniţială.
7.1.2. Detectare cu grup de diode
Rezultatele se evaluează conform următoarelor criterii:
a) lungimea de undă de absorbţie maximă a spectrelor
probei şi a etalonului, înregistrată la vârful picului de cromatogramă, trebuie
să fie aceeaşi într-o marjă determinată de puterea de rezoluţie a sistemului de
detecţie. Pentru detecţia prin grup de diode, aceasta este de obicei de ± 2 nm;
b) între 225 şi 400 nm, spectrele probei şi ale
etalonului, înregistrate la vârful picului pe cromatogramă, trebuie să fie
identice pentru aceste părţi ale spectrului într-un interval de 10-100% al
absorbantei relative. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt prezente
aceleaşi maxime, iar deviaţia dintre cele două spectre nu depăşeşte 15% în
niciun punct observat din absorbanta substanţei etalon de analizat;
c) între 225 şi 400 nm, spectrele curbei ascendente
ale vârfului şi ale curbei descendente a picului, produse de extractul din
probă, trebuie să fie identice pentru acele părţi ale spectrului într-un
interval de 10 - 100% al absorbantei relative. Acest criteriu este îndeplinit
atunci când sunt prezente aceleaşi maxime şi când la toate punctele observate
deviaţia dintre spectre este de maximum 15% din absorbanta spectrului vârfului.
Prezenţa substanţei de analizat este conformă doar dacă
toate criteriile sunt îndeplinite.
7.2. Repetabilitate
Pentru un conţinut de 10 mg/kg şi mai mare, diferenţa
dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe aceeaşi probă
trebuie să fie de cel mult 15% din rezultatul superior.
7.3. Recuperare
Pentru o probă (martor) îmbogăţită, recuperarea trebuie
să fie de minimum 90%.
8. Rezultate ale unui test de colaborare
A fost organizat un studiu de colaborare în care 6
furaje, 4 premixuri şi 3 preparate au fost analizate de 8 laboratoare. Au fost
efectuate analize în dublu pentru fiecare probă. (Mai multe informaţii
detaliate cu privire la acest studiu de colaborare pot fi găsite în Jurnalul
AOAC, volumul 71, 1988, pag. 484-490.) Rezultatele studiului (cu excepţia
valorilor aberante) sunt indicate mai jos:
Tabelul 1. Rezultatele studiului de colaborare pentru
furaje
|
|
Proba 1
|
Proba 2
|
Proba 3
|
Proba 4
|
Proba 5
|
Proba 6
|
|
L
|
8
|
8
|
8
|
8
|
8
|
8
|
|
n
|
15
|
14
|
15
|
15
|
15
|
15
|
|
Medie (mg/kg)
|
50,0
|
47,6
|
48,2
|
49,7
|
46,9
|
49,7
|
|
Sr (mg/kg)
|
2,90
|
2,69
|
1,38
|
1,55
|
1,52
|
2,12
|
|
CVr (%)
|
5,8
|
5,6
|
2,9
|
3,1
|
3,2
|
4,3
|
|
SR (mg/kg)
|
3,92
|
4,13
|
2,23
|
2,58
|
2,26
|
2,44
|
|
CVR (%)
|
7,8
|
8,7
|
4,6
|
5,2
|
4,8
|
4,9
|
|
Conţinut nominal (mg/kg)
|
50,0
|
50,0
|
50,0
|
50,0
|
50,0
|
50,0
|
Tabelul 2. Rezultatele unui studiu de colaborare pentru
premixuri şi preparate
|
|
Premixuri
|
Preparate
|
|
|
A
|
B
|
C
|
D
|
A
|
B
|
C
|
|
L
|
7
|
7
|
7
|
7
|
8
|
8
|
8
|
|
n
|
14
|
14
|
14
|
14
|
16
|
16
|
16
|
|
Medie (g/kg)
|
8,89
|
9,29
|
9,21
|
8,76
|
94,6
|
98,1
|
104
|
|
Sr (g/kg)
|
0,37
|
0,28
|
0,28
|
0,44
|
4,1
|
5,1
|
7,7
|
|
CVr (%)
|
4,2
|
3,0
|
3,0
|
5,0
|
4,3
|
5,2
|
7,4
|
|
SR (g/kg)
|
0,37
|
0,28
|
0,40
|
0,55
|
5,4
|
6,4
|
7,7
|
|
CVR (%)
|
4,2
|
3,0
|
4,3
|
6,3
|
5,7
|
6,5
|
7,4
|
|
Conţinut nominal (g/kg)
|
10,0
|
10,0
|
10,0
|
10,0
|
100
|
100
|
100
|
|
L: număr de laboratoare
n: număr de valori unice
Sr: deviaţie standard a
repetabilităţii
CVr: coeficient de variaţie
a repetabilităţii
SR: deviaţie standard a
reproductibilităţii
CVR: coeficient de variaţie a
reproductibilităţii
|